Karakterisere enkeltmolekylkonformasjonsendringer under skjærstrøm med fluorescensmikroskopi
Summary
Vi presenterer en protokoll for å immobilisere enkeltmakromolekyler i mikrofluidiske enheter og kvantifisere endringer i deres konformasjoner under skjærstrøm. Denne protokollen er nyttig for å karakterisere biomekaniske og funksjonelle egenskaper av biomolekyler som proteiner og DNA i et strømningsmiljø.
Abstract
Enkeltmolekylatferd under mekanisk perturbasjon har blitt karakterisert mye for å forstå mange biologiske prosesser. Metoder som atomkraftmikroskopi har imidlertid begrenset tidsoppløsning, mens Förster resonansenergioverføring (FRET) bare tillater konformasjoner å bli utsatt. Fluorescensmikroskopi, derimot, tillater sanntid in situ visualisering av enkeltmolekyler under ulike strømningsforhold. Vår protokoll beskriver trinnene for å fange konformasjonelle endringer av enkeltbiomolekyler under forskjellige skjærstrømningsmiljøer ved hjelp av fluorescensmikroskopi. Skjærstrømmen opprettes inne i mikrofluidiske kanaler og styres av en sprøytepumpe. Som demonstrasjoner av metoden er von Willebrand-faktor (VWF) og lambda DNA merket med biotin og fluorophore og deretter immobilisert på kanaloverflaten. Deres konformasjoner overvåkes kontinuerlig under variabel skjærstrøm ved hjelp av total intern refleksjon (TIRF) og konfokal fluorescensmikroskopi. Den reversible unraveling dynamikken i VWF er nyttig for å forstå hvordan funksjonen er regulert i menneskelig blod, mens konformasjonen av lambda DNA gir innsikt i biofysikken til makromolekyler. Protokollen kan også brukes mye for å studere atferden til polymerer, spesielt biopolymerer, i varierende strømningsforhold og for å undersøke revologien til komplekse væsker.
Introduction
Mekanismer for hvordan biomolekyler reagerer på miljømessige stimuli har blitt studert mye. I et strømningsmiljø spesielt regulerer skjær- og langeringskrefter konformasjonsendringene og potensielt biomolekylenes funksjon. Typiske eksempler inkluderer skjær-indusert unraveling av lambda DNA og von Willebrand faktor (VWF). Lambda DNA har blitt brukt som et verktøy for å forstå konformasjonsdynamikk av individuelle, fleksible polymerkjeder og revologien til polymerløsninger1,2,3,4. VWF er en naturlig strømningssensor som samler blodplater på sårsteder i blodårene med unormal skjærfrekvens og strømningsmønstre. Unraveling av VWF er avgjørende for å aktivere bindingen av blodplater til A1-domenet og kollagenbinding til A3-domenet. I tillegg, høy skjær-indusert A2 domene utfoldelse tillater spaltning av VWF, som regulerer sin molekylære vektfordeling i sirkulasjon5,6. Dermed kan direkte visualisering av hvordan disse molekylene oppfører seg under strømning i stor grad forbedre vår grunnleggende forståelse av deres biomekanikk og funksjon, noe som igjen kan muliggjøre nye diagnostiske og terapeutiske applikasjoner.
Typiske metoder for å karakterisere enkeltmolekylkonformasjoner inkluderer optiske/magnetiske pinsett, atomkraftmikroskopi (AFM) og enkeltmolekyl Förster resonansenergioverføring (FRET)7. Enkeltmolekylstyrkespektroskopi er et kraftig verktøy for å undersøke kraften og bevegelsen forbundet med konformasjonsendringene av biomolekyler. Det mangler imidlertid evnen til å kartlegge generelle molekylære konformasjoner8. AFM er i stand til å bildebehandling med høy romlig oppløsning, men er begrenset i temporal oppløsning9,10. I tillegg kan kontakt mellom spissen og prøven forvirre responsen forårsaket av flyt. Andre metoder som FRET og nanoporeanalyse bestemmer enkeltmolekylproteinfolding og utfoldelse ser ut basert på påvisning av intramolekylær avstand og ekskluderte volumer. Imidlertid er disse metodene fortsatt i sin barndom og begrenset i sin direkte observasjon av enkeltmolekylkonformasjoner11,12,13,14.
På den annen side har direkte observere makromolekyler med høy temporal og romlig oppløsning under fluorescensmikroskopi forbedret vår forståelse av enkeltmolekyldynamikk i mange biologiske prosesser15,16. For eksempel oppnådde Fu et al. nylig samtidig visualisering av VWF forlengelse og blodplatereseptorbinding for første gang. I sitt arbeid ble VWF-molekyler immobilisert på overflaten av en mikrofluidisk kanal gjennom biotin-streptavidin interaksjoner og avbildet under total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi ved varierende skjærstrømningsmiljøer17. Ved å bruke en lignende metode som Fus, viser vi her at konformasjoner av VWF og lambda DNA kan observeres direkte under både TIRF og konfokal fluorescensmikroskopi. Som vist i figur 1brukes mikrofluidiske enheter til å opprette og kontrollere skjærstrømning, og biomolekyler er immobilisert på kanaloverflaten. Ved bruk av varierende skjærhastigheter registreres konformasjoner av det samme molekylet for å måle forlengelseslengden, også vist i figur 1. Metoden kan brukes mye for å utforske andre polymeratferd under komplekse strømningsmiljøer for både revologiske og biologiske studier.
Protocol
Representative Results
Discussion
For å oppnå data av høy kvalitet av enkeltmolekylkonformasjonsendringer ved hjelp av fluorescensmikroskopi som beskrevet i denne metoden, er det avgjørende å inkubere molekylet i riktig tid, minimere sine uspesifikke interaksjoner med overflaten og etablere mikroskopinnstillinger som reduserer fotobleking. Molekylets evne til fritt å endre konformasjoner er relatert til antall biotin-streptavidin interaksjoner dannet mellom molekylet og overflaten. Som nevnt tidligere, må dette kontrolleres ved å inkubere molekyl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble delvis støttet av en National Science Foundation stipend DMS-1463234, National Institutes of Health tilskudd HL082808 og AI133634, og Lehigh University intern finansiering.
Materials
| Alexa Fluor 488 Labeling Kit | Invitrogen | A30006 | |
| Bio-Spin P-6 Gel Columns | Bio-Rad | 7326221 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Use as free biotin in Step 5.6 |
| Biotin-14-dCTP | AAT Bioquest | 17019 | |
| BSA-Biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Coverslips | VWR | 48393-195 | No. 1 ½, 22 x 50 mm |
| dNTP Set | Invitrogen | 10297018 | |
| Float Buoys for Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69588 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | New England BioLabs | M0212S | Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2 |
| Lambda DNA | New England BioLabs | N3011S | |
| Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69570 | 10K MWCO, 0.1 mL volume |
| NEBuffer 4 | New England BioLabs | B7004S | |
| NHS-PEG4-Biotin | Thermo Scientific | 21330 | |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase | Sigma-Aldrich | P8279 | |
| Protocatechuic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-205818 | |
| Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication | The Dow Chemical Company | 4019862 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 85878 | |
| The Blocking Solution | CANDOR Bioscience | 110 050 | Use as casein blocking solution throughout protocol |
| Vinyl Cleanroom Tape | Fisher Scientific | 19-120-3217 | |
| von Willebrand Factor, Human Plasma | Millipore Sigma | 681300 | |
| YOYO-1 Dye | AAT Bioquest | 17580 | |
| 0.25 mm Inner Diameter Tubing | Cole-Parmer | EW-06419-00 | |
| 25 Gauge Needle | Thomas Scientific | JG2505X |
Riferimenti
- Shaqfeh, E. S. The dynamics of single-molecule DNA in flow. Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).
- Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. Single-polymer dynamics in steady shear flow. Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).
- LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow. Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).
- Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kröger, M., Bausch, A. R. Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime. ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).
- Springer, T. A. Biology and physics of von Willebrand factor concatamers. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Siedlecki, C. A., et al. Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).
- Roiter, Y., Minko, S. AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains. Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).
- Aznauryan, M., et al. Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).
- Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
- Howorka, S., Siwy, Z. Nanopore analytics: sensing of single molecules. Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).
- Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).
- Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
- Xia, T., Li, N., Fang, X. H. Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).
- Fu, H., et al. Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation. Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).
- Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules. Science. 271 (5250), 795-799 (1996).
- Wang, Y., et al. Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor. Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).
- Carlsson, C., Johnsson, M., Åkerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).
- Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: Novel tools for imaging protein–nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
- Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
