Caracterizando mudanças conformais de molécula única fluxo de cisalhamento com microscopia de fluorescência
Summary
Apresentamos um protocolo para imobilizar macromoléculas únicas em dispositivos microfluidos e quantificar mudanças em suas conformações fluxo de cisalhamento. Este protocolo é útil para caracterizar as propriedades biomecânicas e funcionais de biomoléculas, como proteínas e DNA, em um ambiente de fluxo.
Abstract
O comportamento de uma única molécula perturbação mecânica tem sido amplamente caracterizado para entender muitos processos biológicos. No entanto, métodos como microscopia da força atômica têm resolução temporal limitada, enquanto a transferência de energia de ressonância förster (FRET) só permite que conformações sejam inferidas. A microscopia de fluorescência, por outro lado, permite a visualização em tempo real de moléculas únicas em várias condições de fluxo. Nosso protocolo descreve as etapas para capturar alterações conformacionais de biomoléculas únicas em diferentes ambientes de fluxo de cisalhamento usando microscopia de fluorescência. O fluxo de cisalhamento é criado dentro de canais microfluidos e controlado por uma bomba de seringa. Como demonstrações do método, o fator von Willebrand (VWF) e o DNA lambda são rotulados com biotina e fluoroforo e depois imobilizados na superfície do canal. Suas conformações são continuamente monitoradas fluxo de cisalhamento variável utilizando reflexão interna total (TIRF) e microscopia de fluorescência confocal. A dinâmica reversível de desvendar a VWF é útil para entender como sua função é regulada no sangue humano, enquanto a conformação do DNA lambda oferece insights sobre a biofísica das macromoléculas. O protocolo também pode ser amplamente aplicado para estudar o comportamento dos polímeros, especialmente biopolímeros, em condições variadas de fluxo e investigar a reologia de fluidos complexos.
Introduction
Mecanismos de como as biomoléculas respondem a estímulos ambientais têm sido amplamente estudados. Em um ambiente de fluxo em particular, as forças de cisalhamento e alongamento regulam as mudanças conformacionais e potencialmente a função das biomoléculas. Exemplos típicos incluem desvendamento induzido por cisalhamento do DNA lambda e do fator von Willebrand (VWF). O DNA lambda tem sido usado como ferramenta para entender a dinâmica conformação de cadeias de polímeros individuais e flexíveis e a reologia das soluções de polímeros1,2,3,4. VWF é um sensor de fluxo natural que agrega plaquetas em locais de feridas de vasos sanguíneos com taxas de cisalhamento anormal e padrões de fluxo. O desvendamento da VWF é essencial para ativar a vinculação de plaquetas ao domínio A1 e ligação de colágeno ao domínio A3. Além disso, o desdobramento do domínio A2 induzido por cisalhamento permite o decote da VWF, que regula sua distribuição de peso molecular na circulação5,6. Assim, a visualização direta de como essas moléculas se comportam o fluxo pode melhorar muito nossa compreensão fundamental de sua biomecânica e função, que por sua vez podem permitir novas aplicações diagnósticas e terapêuticas.
Metodologias típicas para caracterizar conformações de moléculaúnica incluem pinças ópticas/magnéticas, microscopia de força atômica (AFM) e transferência de energia de ressonância Förster de molécula única (FRET)7. A espectroscopia de força de molécula única é uma poderosa ferramenta para investigar a força e o movimento associados às mudanças conformacionais de biomoléculas. No entanto, não tem a capacidade de mapear conformações moleculares globais8. A AFM é capaz de imagens com alta resolução espacial, mas é limitada na resolução temporal9,10. Além disso, o contato entre a ponta e a amostra pode confundir a resposta induzida pelo fluxo. Outros métodos como a ANÁLISE frete e nanopore determinam o dobrável e desdobramento de proteínas de molécula única com base na detecção de distância molecular e volumes excluídos. No entanto, esses métodos ainda estão em sua infância e limitados em sua observação direta de conformações unimoléculas11,12,13,14.
Por outro lado, observar diretamente macromoléculas com alta resolução temporal e espacial microscopia de fluorescência melhorou nossa compreensão da dinâmica de moléculaúnica em muitos processos biológicos15,16. Por exemplo, Fu et al. recentemente alcançaram visualização simultânea de alongamento VWF e ligação receptor a plaqueta pela primeira vez. Em seu trabalho, as moléculas vwf foram imobilizadas na superfície de um canal microfluido através de interações biotina-streptavidin e imagens reflexão interna total fluorescência (TIRF) microscopia em diferentes ambientes de fluxo de cisalhamento17. Aplicando um método semelhante ao de Fu, demonstramos aqui que conformações de DNA VWF e lambda podem ser observadas diretamente microscopia de fluorescência TIRF e confocal. Como mostrado na Figura 1,dispositivos microfluidos são usados para criar e controlar o fluxo de cisalhamento, e as biomoléculas são imobilizadas na superfície do canal. Após a aplicação de diferentes taxas de cisalhamento, conformações da mesma molécula são registradas para medir o comprimento extensão, também mostrado na Figura 1. O método poderia ser amplamente aplicado para explorar outros comportamentos de polímeros em ambientes de fluxo complexos para estudos reológicos e biológicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para obter dados de alta qualidade de alterações conformais de molécula única usando microscopia de fluorescência como descrito neste método, é fundamental incubar a molécula pela quantidade adequada de tempo, minimizar suas interações inespecíficas com a superfície e estabelecer configurações de microscópio que reduzem o fotobranqueamento. A capacidade da molécula de mudar livremente a conformação está relacionada ao número de interações biotina-streptavidin formada entre a molécula e a superfíci…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado em parte por uma Fundação Nacional de Ciência sacada dMS-1463234, Institutos Nacionais de Saúde concede HL082808 e AI133634, e financiamento interno da Universidade Lehigh.
Materials
| Alexa Fluor 488 Labeling Kit | Invitrogen | A30006 | |
| Bio-Spin P-6 Gel Columns | Bio-Rad | 7326221 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Use as free biotin in Step 5.6 |
| Biotin-14-dCTP | AAT Bioquest | 17019 | |
| BSA-Biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Coverslips | VWR | 48393-195 | No. 1 ½, 22 x 50 mm |
| dNTP Set | Invitrogen | 10297018 | |
| Float Buoys for Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69588 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | New England BioLabs | M0212S | Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2 |
| Lambda DNA | New England BioLabs | N3011S | |
| Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69570 | 10K MWCO, 0.1 mL volume |
| NEBuffer 4 | New England BioLabs | B7004S | |
| NHS-PEG4-Biotin | Thermo Scientific | 21330 | |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase | Sigma-Aldrich | P8279 | |
| Protocatechuic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-205818 | |
| Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication | The Dow Chemical Company | 4019862 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 85878 | |
| The Blocking Solution | CANDOR Bioscience | 110 050 | Use as casein blocking solution throughout protocol |
| Vinyl Cleanroom Tape | Fisher Scientific | 19-120-3217 | |
| von Willebrand Factor, Human Plasma | Millipore Sigma | 681300 | |
| YOYO-1 Dye | AAT Bioquest | 17580 | |
| 0.25 mm Inner Diameter Tubing | Cole-Parmer | EW-06419-00 | |
| 25 Gauge Needle | Thomas Scientific | JG2505X |
Riferimenti
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