הפגנת קשר ליניארי בין גורם גידול של כלי דם אנדותל והורמון מחלגיזציה בתמציות קליפת הכליה
Summary
מוצג כאן הוא פרוטוקול לניצול הכנה לתמצית כליה קליפת הכליה ונורמליזציה חלבון מוחלט כדי להדגים את הקורלציה בין גורם הצמיחה של כלי הדם והורמון החלמיזציה בכליות היונקים.
Abstract
גורם הגדילה של כלי הדם (מסייע) לשלוט באנגיוגנזה ובחדירות כלי הדם בכליה. הפרעות כליות, כגון כלייתית סוכרתית, משויכות לדיסתקנה של הכליות. הגורמים השולטים ב-, בתנאים הפיזיולוגיים בכליות, אינם מובנים היטב. הורמון מחלפף (LH), הורמון פרו-אנגיוגנטי, מסייע לווסת את הביטוי הפיזיולוגי באברי הרבייה. בהינתן כי קולטני LH נמצאים בכליה, אנחנו, במכון מחקר זיגצ’יק, שיערו כאן כי LH גם מסייע לווסת את הביטוי בכליה כמו גם. כדי לספק ראיות, כיוונו להראות כי רמות LH מסוגלים לנבא רמות של היונקים בכליה. רוב החקירות הקשורות לנושא הכרוך בכליות השתמשו ביונקים בעלי סדר נמוך יותר כמודלים (כלומר, מכרסמים וארנבים). כדי לתרגם את העבודה הזאת לגוף האנושי, הוחלט לבחון את הקשר בין המערכת הבין הגדולה לבין ה-LH לבין יונקים בעלי סדר גבוה יותר (קרי, מודלים של שור ופורצין). פרוטוקול זה משתמש בחלבון מוחלט. מקליפת הכליה המפתחות להצלחת שיטה זו כוללים רכש של כליות מחיות מטבחיים מיד לאחר המוות, כמו גם נורמליזציה של רמות אנליטה (בתמצית הכליה) על ידי חלבון מוחלט. מחקר זה ממחיש בהצלחה קשר ליניארי משמעותי בין LH ו-ובהן כליות השור ו חזירי. התוצאות מתוכונות. בשני זנים שונים המחקר מספק הוכחות תומכות כי השימוש בתמציות כליות מפרות וחזירים הם משאב מעולה, חסכוני, ושופע לחקר הפיזיולוגיה של הכליות, במיוחד עבור בחינת הקורלציה בין מנתחי ה-, והאנליטים אחרים.
Introduction
גורם הצמיחה של כלי הדם a (“וכדומה”), מסייע לווסת אנגיוגנזה וחדירות כלי הדם בכליות ובאיברים אחרים1,2 (להלן, המכונה “הנקרא” מכונה “כולי”). רמות הטיפול בכליה הן תחת שליטה הומאטית. כאשר רמות הכליות מוגברות או מדוכאים, הכליה עלולה להיות תקלה. לדוגמה, בתוך 3 שבועות לאחר הלידה, עכברים עם הטרוזיזטיות מיוחדות לפיתוח של ה-“ולפתח” אנדוקיזיס וכלי-דם (כלומר, נגעים כליות הנתפסים באקלמפסיה האנושית), וכישלון כליות בשלב הסופי מתרחש בהטרוזיטים אלה בגיל 3 חודשים. Podocyte הומוזיטים מסוימים מתים מפני הידרופס ואי ספיקת כליות בתוך יום אחד של לידה3,4.
מצד שני, ביטוי יתר של כליות הכליות גורם פרוטאינוריה ו-היפרפרפיה של הכליה3,4. לדוגמה, ארנבים טרנסגניים המבטאים את התצוגה המתקדמת של התערוכה מתקדמת באמצעות שיעורי סינון מוגברים בשלבים המוקדמים של נפרופתיה, ואחריו שיעורי סינון מופחת בשלבים מאוחרים יותר3. סוכרת כליירופאתי, הגורם העיקרי של מחלת הכליה בשלב הסופי אצל מבוגרים סוכרתית, הוא מקושר באופן משמעותי עם התקנה ברמה2,5. הרבה תשומת לב שולמו לתפקיד של היפוקסיה בגרימת ביטוי ה-, בתנאים פתולוגיים5. עם זאת, הגורמים השולטים במצב הפיזיולוגי (הן בכליה והן באיברים אחרים) אינם מובנים היטב2,6. זיהוי גורמים אלה (למעט חמצן) המעורבים ברגולציה הפיזיולוגית והפתולוגית היא משימה חשובה.
הורמון מחלפף (LH), הורמון פרו-אנגיוגנטי, מסייע לווסת את הביטוי הפיזיולוגי באברי הרבייה כגון השחלה והטנות7,8. מחקרים קודמים סיפקו ראיות כי LH גם עוזר לווסת את הגוף באיברים שאינם רבייה, כגון העיניים6,9,10. קולטנים LH מצויים לשד הקליפה של הכליה11,12. של הערה, כליה תאים אפיתל הכרישים, כמו גם את הקולטן LH, אקספרס וואפ11,12,13,14. לוקחים את שני התצפיות האלה יחד, אנו שיערו כי LH גם עוזר לווסת את הביטוי והוא בכליה13,14. כדי לספק ראיות של הקשר LH/מערכת זו, הפרוטוקול המוצג שואפת להראות כי רמות LH מסוגלים לנבא רמות של הכליה. מספר רב של חקירות קודמות הקשורות בכליות השתמשו במודלים היונקים הנמוכים ביותר (כלומר, מכרסמים וארנבים)2. כדי לתרגם את העבודה הזאת לגוף האנושי, המחקר בוחן את היחסים בין ומעלה LH ביותר יונקים בסדר גבוה (כאן, שור מודלים חזירי). כדי לבצע מטרה זו, חלבון מוחלט ליפוסט היה מוכן באזור קליפת המוח של שור וכליות חזירי.
Protocol
Representative Results
Discussion
לרכישת כליות מהמטבחיים מיד לאחר מוות בעלי חיים הוא המפתח להצלחה במתודולוגיה זו. זהו היתרון העיקרי של ניצול איברים מפרות וחזירים במקום גופות אדם. בדרך כלל יש לפחות עיכוב של 12-24 h מזמן המוות עד שאיברי הגוף האנושיים מושגו. בגלל ההרכב הכימי של איברי הגוף משתנה באופן משמעותי בתוך 2 h לאחר המוות<sup …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לקבוצת המטבחיים (Blissfield, MI) לאספקת הכליות של השור והכיצין. לא היה צורך במימון מענק למחקר זה.
Materials
| Bovine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS700951 | |
| Bovine VEGF-A ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS2887434 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 23235 | |
| Porcine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS009739 | |
| Porcine VEGF-A ELISA | Ray Biotech, Norcross, GA. | ELP-VEGFA-1 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 89901 |
Riferimenti
- Advani, A., et al. Role of VEGF in maintaining renal structure and function under normotensive and hypertensive conditions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (36), 14448-14453 (2007).
- Majumder, S., Advani, A. VEGF and the diabetic kidney: More than too much of a good thing. Journal of Diabetes and its Complications. 31 (1), 273-279 (2017).
- Liu, E., et al. Increased expression of vascular endothelial growth factor in kidney leads to progressive impairment of glomerular functions. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (7), 2094-2104 (2007).
- Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
- Ferrara, N. Vascular endothelial growth factor: basic science and clinical progress. Endocrine Reviews. 25 (4), 581-611 (2004).
- Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Vitreous Levels of Luteinizing Hormone and VEGF are Strongly Correlated in Healthy Mammalian Eyes. Current Eye Research. 43 (8), 1041-1044 (2018).
- Babitha, V., et al. Luteinizing hormone, insulin like growth factor-1, and epidermal growth factor stimulate vascular endothelial growth factor production in cultured bubaline granulosa cells. General and Comparative Endocrinology. 198, 1-12 (2014).
- Trau, H. A., Davis, J. S., Duffy, D. M. Angiogenesis in the Primate Ovulatory Follicle Is Stimulated by Luteinizing Hormone via Prostaglandin E2. Biology of Reproduction. 92 (1), 15 (2015).
- Movsas, T. Z., et al. Confirmation of Luteinizing Hormone (LH) in Living Human Vitreous and the Effect of LH Receptor Reduction on Murine Electroretinogram. Neuroscienze. 385, 1-10 (2018).
- Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Elimination of Signaling by the Luteinizing Hormone Receptor Reduces Ocular VEGF and Retinal Vascularization during Mouse Eye Development. Current Eye Research. 43 (10), 1286-1289 (2018).
- Hipkin, R. W., Sanchez-Yague, J., Ascoli, M. Identification and characterization of a luteinizing hormone/chorionic gonadotropin (LH/CG) receptor precursor in a human kidney cell line stably transfected with the rat luteal LH/CG receptor complementary DNA. Molecular Endocrinology. 6 (12), 2210-2218 (1992).
- Lei, Z. M., et al. Targeted disruption of luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin receptor gene. Molecular Endocrinology. 15 (1), 184-200 (2001).
- Schrijvers, B. F., Flyvbjerg, A., De Vriese, A. S. The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology. Kidney International. 65 (6), 2003-2017 (2004).
- Apaja, P. M., Aatsinki, J. T., Rajaniemim, H. J., Petaja-Repo, U. E. Expression of the mature luteinizing hormone receptor in rodent urogenital and adrenal tissues is developmentally regulated at a posttranslational level. Endocrinology. 146 (8), 3224-3232 (2005).
- Ondruschka, B., et al. Post-mortem in situ stability of serum markers of cerebral damage and acute phase response. International Journal of Legal Medicine. 133 (3), 871-881 (2019).
- Swain, R., et al. Estimation of post-mortem interval: A comparison between cerebrospinal fluid and vitreous humour chemistry. Journal of Forensic and Legal Medicine. 36, 144-148 (2015).
- Thompson, C. S., Traynor, I. M., Fodey, T. L., Faulkner, D. V., Crooks, S. R. H. Screening method for the detection of residues of amphenicol antibiotics in bovine, ovine and porcine kidney by optical biosensor. Talanta. 172, 120-125 (2017).
- Konstantinou, G. N. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods in Molecular Biology. 1592, 79-94 (2017).
- Levesque, B. M., et al. Low urine vascular endothelial growth factor levels are associated with mechanical ventilation, bronchopulmonary dysplasia and retinopathy of prematurity. Neonatology. 104 (1), 56-64 (2013).
- Leviton, A., et al. Antecedents and early correlates of high and low concentrations of angiogenic proteins in extremely preterm newborns. Clinica Chimica Acta. 471, 1-5 (2017).
- Simo-Servat, O., Hernandez, C., Simo, R. Usefulness of the vitreous fluid analysis in the translational research of diabetic retinopathy. Mediators of Inflammation. , 872978 (2012).
- Sharma, R. K., Rowe-Rendleman, C. L. Validation of molecular and genomic biomarkers of retinal drug efficacy: use of ocular fluid sampling to evaluate VEGF. Neurochemical Research. 36 (4), 655-667 (2011).
