Demonstrere en lineær sammenheng mellom vaskulær endothelial vekstfaktor og luteiniserende hormon i nyre cortex ekstrakter
Summary
Presentert her er en protokoll for å utnytte en kortikale nyre ekstrakt forberedelse og total protein normalisering å demonstrere sammenhengen mellom vaskulær endothelial vekstfaktor og luteiniserende hormon i pattedyr nyre.
Abstract
Vaskulær endothelial vekstfaktor (VEGF) bidrar til å kontrollere angiogenese og vaskulær permeabilitet i nyrene. Nyre sykdommer, som diabetisk nefropati, er forbundet med VEGF feilregulering i nyrene. Faktorene som regulerer VEGF under fysiologiske forhold i nyrene er ikke godt forstått. Luteiniserende hormon (LH), en Pro-angiogenic hormon, bidrar til å regulere fysiologiske VEGF uttrykk i reproduktive organer. Gitt at LH reseptorer er funnet i nyrene, vi, ved Zietchick Research Institute, hypotetisk gjennomsnitt her at LH også bidrar til å regulere VEGF uttrykk i nyre også. For å gi bevis, hadde vi som mål å vise at LH nivåene er i stand til å forutsi VEGF nivåer i pattedyr nyre. De fleste VEGF-relaterte undersøkelser som involverer nyrene har brukt lavere orden pattedyr som modeller (dvs. gnagere og kaniner). For å oversette dette arbeidet til menneskekroppen, ble det besluttet å undersøke forholdet mellom VEGF og LH i høyere orden pattedyr (dvs. storfe og svin modeller). Denne protokollen bruker den totale protein lysat fra nyre barken. Nøkler til denne metoden suksess inkluderer anskaffelse av nyrer fra slakteri dyr umiddelbart etter døden, samt normalisering av analytt nivåer (i nyre ekstrakt) av total protein. Denne studien demonstrerer vellykket en betydelig lineær sammenheng mellom LH og VEGF i både storfe og svin nyrer. Resultatene er reproduserbar i to forskjellige arter. Studien gir støtte bevis for at bruk av nyre ekstrakter fra kyr og griser er en utmerket, økonomisk og rikelig ressurs for studiet av nyre fysiologi, spesielt for å undersøke sammenhengen mellom VEGF og andre analytter.
Introduction
Vaskulær endothelial vekstfaktor A (VEGF-a), bidrar til å regulere angiogenese og vaskulær permeabilitet i nyrene og andre organer1,2 (heretter, VEGF-a vil bli referert til som VEGF). VEGF nivåer i nyrene er under stram homøostatisk kontroll. Når nyre VEGF nivåer er forhøyet eller deprimert, nyre kan funksjonsfeil. For eksempel, innen 3 uker etter fødselen, mus med podocyte-spesifikke heterozygosity for VEGF utvikle endotheliosis og ublodig glomeruli (dvs. nyre lesjoner sett i Human preeclampsia), og slutt-stadium nyresvikt oppstår i disse heterozygotes av 3 måneders alder. Podocyte-spesifikke heterozygot Knockouts dø av hydrops og nyresvikt innen 1 dag etter fødselen3,4.
På den annen side, overuttrykte av nyre VEGF forårsaker proteinuri og glomerulær hypertrofi3,4. For eksempel, transgene kaniner som overekspresjon VEGF utstillingen progressive proteinuri med økt glomerulær filtrering priser i tidlige stadier av nefropati, etterfulgt av redusert glomerulær filtrering priser i senere stadier3. Diabetisk nefropati, en viktig årsak til sluttfasen nyresykdom hos diabetiker voksne, er sterkt assosiert med VEGF feilregulering2,5. Mye oppmerksomhet har blitt betalt til rollen som hypoksi i inducing VEGF uttrykk under patologisk forhold5. Men de faktorene som regulerer VEGF under fysiologiske forhold (både i nyre og andre organer) er ikke godt forstått2,6. Identifisere disse faktorene (med unntak av oksygen) som er involvert i fysiologiske og patologisk VEGF regulering er en viktig oppgave.
Luteiniserende hormon (LH), en Pro-angiogenic hormon, hjelper regulere fysiologiske VEGF uttrykk i reproduktive organer som eggstokken og testikkel7,8. Tidligere studier har gitt bevis for at LH også bidrar til å regulere VEGF i ikke-reproduktive organer, slik som øynene6,9,10. LH reseptorer finnes i forlengede og cortex av nyrene11,12. Av notatet, nyre rørformede epitelceller, så vel som LH reseptor, Express VEGF11,12,13,14. Ved å ta disse to observasjonene sammen, hypotetisk gjennomsnitt vi at LH også bidrar til å regulere VEGF uttrykk i nyrene13,14. For å gi bevis på dette LH/VEGF forholdet, har den presenterte protokollen som mål å vise at LH nivåer er i stand til å forutsi VEGF nivåer i nyrene. Mange tidligere VEGF-relaterte undersøkelser som involverer nyrene har brukt lavere orden pattedyr modeller (dvs. gnagere og kaniner)2. For å oversette dette arbeidet til menneskekroppen, undersøker studien forholdet mellom VEGF og LH i høyere orden pattedyr (her, storfe og svin modeller). For å gjennomføre dette målet, total protein lysat ble fremstilt fra cortex regionen av storfe og svin nyrer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anskaffelse nyrer fra for slakterier umiddelbart etter at dyret død er nøkkelen til suksess i denne metodikken. Dette er den største fordelen med å utnytte organer fra kyr og griser i stedet for menneskelig levningene. Det er vanligvis minst en 12-24 h forsinkelse fra tidspunktet for dødsfallet til menneskelige Cadaver organer er anskaffet. Fordi den kjemiske sammensetningen av kroppslige organer betydelig endringer innen 2 h etter obduksjon15,16, VEGF-studi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Scholl ‘ s slakteri (Blissfield, MI) for å gi storfe og svin nyrer. Ingen tilskuddsmidler ble benyttet for denne studien.
Materials
| Bovine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS700951 | |
| Bovine VEGF-A ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS2887434 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 23235 | |
| Porcine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS009739 | |
| Porcine VEGF-A ELISA | Ray Biotech, Norcross, GA. | ELP-VEGFA-1 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 89901 |
Riferimenti
- Advani, A., et al. Role of VEGF in maintaining renal structure and function under normotensive and hypertensive conditions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (36), 14448-14453 (2007).
- Majumder, S., Advani, A. VEGF and the diabetic kidney: More than too much of a good thing. Journal of Diabetes and its Complications. 31 (1), 273-279 (2017).
- Liu, E., et al. Increased expression of vascular endothelial growth factor in kidney leads to progressive impairment of glomerular functions. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (7), 2094-2104 (2007).
- Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
- Ferrara, N. Vascular endothelial growth factor: basic science and clinical progress. Endocrine Reviews. 25 (4), 581-611 (2004).
- Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Vitreous Levels of Luteinizing Hormone and VEGF are Strongly Correlated in Healthy Mammalian Eyes. Current Eye Research. 43 (8), 1041-1044 (2018).
- Babitha, V., et al. Luteinizing hormone, insulin like growth factor-1, and epidermal growth factor stimulate vascular endothelial growth factor production in cultured bubaline granulosa cells. General and Comparative Endocrinology. 198, 1-12 (2014).
- Trau, H. A., Davis, J. S., Duffy, D. M. Angiogenesis in the Primate Ovulatory Follicle Is Stimulated by Luteinizing Hormone via Prostaglandin E2. Biology of Reproduction. 92 (1), 15 (2015).
- Movsas, T. Z., et al. Confirmation of Luteinizing Hormone (LH) in Living Human Vitreous and the Effect of LH Receptor Reduction on Murine Electroretinogram. Neuroscienze. 385, 1-10 (2018).
- Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Elimination of Signaling by the Luteinizing Hormone Receptor Reduces Ocular VEGF and Retinal Vascularization during Mouse Eye Development. Current Eye Research. 43 (10), 1286-1289 (2018).
- Hipkin, R. W., Sanchez-Yague, J., Ascoli, M. Identification and characterization of a luteinizing hormone/chorionic gonadotropin (LH/CG) receptor precursor in a human kidney cell line stably transfected with the rat luteal LH/CG receptor complementary DNA. Molecular Endocrinology. 6 (12), 2210-2218 (1992).
- Lei, Z. M., et al. Targeted disruption of luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin receptor gene. Molecular Endocrinology. 15 (1), 184-200 (2001).
- Schrijvers, B. F., Flyvbjerg, A., De Vriese, A. S. The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology. Kidney International. 65 (6), 2003-2017 (2004).
- Apaja, P. M., Aatsinki, J. T., Rajaniemim, H. J., Petaja-Repo, U. E. Expression of the mature luteinizing hormone receptor in rodent urogenital and adrenal tissues is developmentally regulated at a posttranslational level. Endocrinology. 146 (8), 3224-3232 (2005).
- Ondruschka, B., et al. Post-mortem in situ stability of serum markers of cerebral damage and acute phase response. International Journal of Legal Medicine. 133 (3), 871-881 (2019).
- Swain, R., et al. Estimation of post-mortem interval: A comparison between cerebrospinal fluid and vitreous humour chemistry. Journal of Forensic and Legal Medicine. 36, 144-148 (2015).
- Thompson, C. S., Traynor, I. M., Fodey, T. L., Faulkner, D. V., Crooks, S. R. H. Screening method for the detection of residues of amphenicol antibiotics in bovine, ovine and porcine kidney by optical biosensor. Talanta. 172, 120-125 (2017).
- Konstantinou, G. N. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods in Molecular Biology. 1592, 79-94 (2017).
- Levesque, B. M., et al. Low urine vascular endothelial growth factor levels are associated with mechanical ventilation, bronchopulmonary dysplasia and retinopathy of prematurity. Neonatology. 104 (1), 56-64 (2013).
- Leviton, A., et al. Antecedents and early correlates of high and low concentrations of angiogenic proteins in extremely preterm newborns. Clinica Chimica Acta. 471, 1-5 (2017).
- Simo-Servat, O., Hernandez, C., Simo, R. Usefulness of the vitreous fluid analysis in the translational research of diabetic retinopathy. Mediators of Inflammation. , 872978 (2012).
- Sharma, R. K., Rowe-Rendleman, C. L. Validation of molecular and genomic biomarkers of retinal drug efficacy: use of ocular fluid sampling to evaluate VEGF. Neurochemical Research. 36 (4), 655-667 (2011).
