腸透過性と上皮細胞流れ性能を評価する生体内顕微鏡ベースのアプローチ
Summary
生体内顕微鏡を利用して、ここで提示される方法は、生きている動物の腸上皮細胞脱落のリアルタイム視覚化を可能にする。従って、麻酔化マウスの局所染色された腸粘膜(アクリフラビン及びローダミンB-デキストラン)は、共焦点顕微鏡を用いて単細胞分解能まで画像化される。
Abstract
共焦点イメージングを用いた腸内顕微鏡検査により、生きている動物における上皮細胞脱落やバリア漏れのリアルタイム観察が可能です。したがって、麻酔化マウスの腸管粘膜は、非特異的染色(アクリフラビン)および蛍光トレーサー(rhodamine-Bデキストラン)で局所染色され、生理食い溶液リンスプレートに取り付けられ、共焦点顕微鏡を用いて直接画像化される。この技術は、経口投与トレーサーの経粘膜通過のような腸透過性の漏れを同定する他の非侵襲的な技術を補完することができる。この他に、ここで紹介するアプローチでは、リアルタイムで細胞脱落イベントを直接観察することができます。適切な蛍光レポーターマウスと組み合わせて、このアプローチは、腸上皮細胞の押出を制御する細胞および分子機構、ならびに他の生物学的プロセスに光を流すのに適しています。過去数十年の間に、生体内顕微鏡を用いた興味深い研究は、内皮透過性、免疫細胞腸管ホーミング、免疫上皮通信、および発光成分の侵入に関する知識に寄与してきた。ここで紹介するプロトコルは、上皮細胞押出を制御するメカニズムの理解を深めるだけでなく、他の組織であっても他の非常に動的な細胞プロセスを視覚化する手段として使用される他のアプローチの発達の基礎となる可能性もある。技術的な制限の中で、特定の組織の光学特性、ならびに選択されたイメージング技術および顕微鏡構成は、順番に、撮像作業距離、および取得画像の分解能を決定するであろう。
Introduction
腸は、競合するプロセス、すなわち栄養と有害な発光物質に対する保護を可能にする厳しく調節された機能を持つ高度に専門化された器官です。腸上皮は、人体と環境の間に内層であり、物理的および免疫学的障壁として作用し、腸内の粘膜恒常性の維持に寄与する。上皮完全性の喪失および緊密な接合透過性の増加は、炎症性腸疾患(IBD)3、4、5、6に関連することがよく知られている。3,4,5,6上皮変化は、IBDにおける慢性腸炎の原因および二次増幅器と考えられる。したがって、IBD患者の腸内の初期上皮変化に対する理解の向上は、信頼性の高い予測とその後のIBD再発の予防のために上皮の完全性を回復するための新しい戦略の開発にとって非常に価値があるだろう。
腸上皮は複雑で厳しく調節されたターンオーバープロセスに従う。陰窩下から、多能性幹細胞に由来する末期分化された腸上皮細胞(IEC)が、上方に移動して、老化/損傷した細胞が内腔7に流される。分裂と細胞押出との間の平衡は、腸の上皮細胞数の維持を可能にし、ギャップおよび漏出の形成を回避し、また細胞塊および腫瘍化をもたらす可能性のある上皮細胞の蓄積を88、9、109,10に導く。腸上皮の生理的再生における上皮細胞脱落の重要な役割にもかかわらず、ビロス先端で細胞の押出を駆動する分子メカニズムに関する知識は限られている。したがって、上皮細胞の脱落に関与する分子事象の配列を正確に記述する基礎研究が必要である。
腸粘膜内の異なる細胞型間の複雑な相互作用は、上皮のターンオーバーと腸内恒常性を調節する分子メカニズムを理解する鍵となる。したがって、in vivo研究は、この文脈におけるin vitroおよびex vivoアプローチよりも高い利点を提供する。さらに、リアルタイムイメージング技術により、特定の現象を制御する一連のイベントの記述が可能になります。この文脈では、高度に動的なプロセスの研究は、組織の直接観察のための最適化された高解像度技術の使用を要求する。生体内イメージング技術は、腸内の上皮細胞脱落の研究に適したユニークなツールとして現れます。
「生体内顕微鏡」という用語は、高解像イメージング技術(多光子または共焦点顕微鏡)を利用して、生きている動物11内の自在の環境内の細胞および組織を直接可視化する実験的アプローチを指す。それは単一細胞の決断にin vivo情報の実時間獲得を可能にし、静的か低い決断方法より明確な利点を伴う。生体内顕微鏡は補完的な情報を提供し、組織処理による人工物など、古典的な技術やハイエンド技術からいくつかの制限を克服します。対照的に、生体内顕微鏡の主な制限は、組織が顕微鏡に直接さらされるべきであり、ほとんどの場合、手術が必要です。高度なアプローチは、生力性を維持し、画像化された組織(皮膚の外向室およびイメージング窓)12、13の影響を最小限に抑えるが、ほとんどの場合、13組織(皮膚フラップ)14の外的化のために単純な皮膚切開が行われる。過去10年間で、これらのアプローチは、以前は不可解であった非常にダイナミックなプロセスに関する重要な証拠を貢献してきました。翻訳的には、リアルタイムイメージングは、幹細胞および白血球ホーミング15、ならびに癌播種および転移形成13、16に関する新たな生物学的洞察を提供した。13臨床文脈では、内視鏡検査は現在、癌17および胃腸疾患の診断ツールとして利用されている、例えばIBD18、19;,19共焦点モザイク顕微鏡は手術中に急速な病理学ツールとなった間 20.一緒に、生体内顕微鏡は最近、バイオメディカル研究とクリニックでの将来の応用のための貴重で汎用性の高いツールとして浮上しています。
腸上皮漏れのリアルタイム可視化と上皮細胞脱落事象の観察のために、インビタル顕微鏡が実施されています。腸透過性の漏出は、血清21における蛍光トレーサーの経口投与の定量化などの生体内非侵襲的技術によって同定することができる。しかし、この技術は、流れ性能の直接的な観察や、パラセルラーとトランスセルラー透過性の間の分離を直接観察することはできません。標準的なトレーサー実験と生体内顕微鏡の組み合わせは、i)腸透過性の障害を同定し、ii)パラ細胞とトランス細胞上皮透過性の間で分離する適切なアプローチを表す。細胞流動以外にも、生体内蛍光標識と組み合わせた生体内顕微鏡検査は、他の細胞および分子機構の研究を可能にする(例えば、蛍光レポーターマウス22 を用いた細胞脱落時の緊密な接合点の再分配または腸粘膜23内のIECと他の細胞との相互作用)。
ここで提示した方法は、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)を用いて腸粘膜をリアルタイムに観察できるように、生体内顕微鏡の適応を表しています。したがって、GGTAS(ゲラニルゲラニルトランスビセ酵素)の条件付きノックアウトマウスを腸管上皮細胞(Pggt1biΔIEC マウス)において用い、重度の腸疾患および上皮透過性の増加に苦しんでおります。マウスの外科的調製および腸粘膜の染色、ならびにイメージング獲得および取得後分析に使用される適切な設定が記載されている。このプロトコルは、腸上皮細胞脱落のダイナミクスと運動学に関する現在の知識に寄与する将来の研究を可能にする可能性がある。さらに、このプロトコルは、腸粘膜の表面、さらには他の組織で起こる他の現象を研究するための様々な適応の基礎として役立つ可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
技術的には困難ですが、生体内顕微鏡ベースの方法論は、細胞流動性能など、動的な細胞プロセスをリアルタイムで可視化する独自の実験的アプローチを表しています。これまでのところ、生体内で細胞押出を可視化する代替実験的アプローチはない。このプロトコルは、腸内恒常性の維持に役割を果たす多様な細胞プロセスの記述に寄与できると考えています。
生体?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
これらの結果に至る研究は、欧州連合(EU)第7回枠組みプログラム(FP7/2007-2013)のREA交付契約番号302170の下でピープルプログラム(マリー・キュリー・アクションズ)から資金を受け取っています。エアランゲン・ニュルンベルク大学の臨床研究のための学際的なセンター (IZKF) ;ドイツ研究評議会(DFG)の共同研究センターTRR241および臨床研究グループKFO257;とDFG.
Materials
| Acriflavine hydrochloride | Sigma Aldrich | A8251 | 1 mg/mL solution in PBS |
| Deltaphase isothermal pad | BrainTree | B-DP-PAD | – |
| Gemini Cautery System | BrainTree | B-GEM-5917 | – |
| Ketamin | WDT | 9089.01.00 | |
| LAS X | Leica | – | – |
| LSM microscope SP8 | Leica | – | – |
| PBS | Biochrom | L182 | |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1824 | 10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution |
| Standard forceps (Dumont SS) | Fine Science Tools | 11203-23 | – |
| Straight fine scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | – |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | 50 mg/mL in ethanol |
| Xylazin | Bayer | 1320422 |
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