LarverSPA, en metode til montering Drosophila Larver for langsigtet Time-Lapse Imaging
Summary
Denne protokol beskriver en metode til montering af Drosophila larver for at opnå længere end 10 timer uafbrudt tid-lapse billeddannelse i intaktlevende dyr. Denne metode kan bruges til at forestille mange biologiske processer tæt på larve kroppen væggen.
Abstract
Live imaging er en værdifuld tilgang til at undersøge cellebiologi spørgsmål. Den Drosophila larver er særligt velegnet til in vivo live imaging fordi larve kroppen væggen og de fleste indre organer er gennemsigtige. Men kontinuerlig live imaging af intaktE Drosophila larver i længere end 30 min har været udfordrende, fordi det er vanskeligt at noninvasively immobiliserende larver i lang tid. Her præsenterer vi en larve montering metode kaldet LarvaSPA, der giver mulighed for kontinuerlig billeddannelse af levende Drosophila larver med høj tidsmæssig og rumlig opløsning i mere end 10 timer. Denne metode indebærer delvis fastgørelse larver til dæksslip ved hjælp af en UV-reaktiv lim og desuden fastholde larve bevægelse ved hjælp af en polydimethylsiloxan (PDMS) blok. Denne metode er kompatibel med larver på udviklingsstadier fra anden instar til vandrer tredje instar. Vi demonstrerer anvendelser af denne metode i at studere dynamiske processer af Drosophila somatosensoriske neuroner, herunder dendrite vækst og skade-induceret dendrite degeneration. Denne metode kan også anvendes til at studere mange andre cellulære processer, der sker i nærheden af larve kroppen væggen.
Introduction
Time-lapse live imaging er en kraftfuld metode til at studere dynamiske cellulære processer. Den rumlige og tidsmæssige oplysninger fra time-lapse film kan afsløre vigtige detaljer for besvarelse af cellebiologi spørgsmål. Den Drosophila larver har været en populær in vivo model for undersøgelser ved hjælp af levende billeddannelse, fordi dens gennemsigtige krop væg giver mulighed for noninvasive billeddannelse af interne strukturer1,2. Desuden findes der talrige genetiske værktøjer i Drosophila til fluorescerende mærke anatomiske strukturer og makromolekyler3. Men, langsigtet tid-lapse billeddannelse af Drosophila larver er udfordrende. I modsætning til stationære tidlige embryoner eller pupper, Drosophila larver bevæge sig konstant, nødvendiggør immobilisering for live imaging. Effektive måder at immobilisere levende Drosophila larver omfatter montering i halocarbon olie med chloroform4, bedøvelse ved hjælp af isofluran eller Dichlorvos opløsning5, og komprimere mellem dæksrids og mikroskop dias6. Selv om nogle af disse metoder er blevet brugt til mikroskopi, ingen af dem er effektiv til langsigtet live imaging. Andre metoder blev udviklet til billeddannelse kropsvæg neuroner i kravle nde larver ved hjælp af konventionelle konfokale mikroskopi eller light-sheet mikroskopi7,8,9. Men disse metoder er ikke ideelle til overvågning cellulære dynamik på grund af flytning af larver.
Der er udviklet nye metoder for at opnå langsigtet tidsforfaldsscanning af Drosophila larver. Ved hjælp af en polydimethylsiloxan (PDMS) “larver chip”, Drosophila larver kan effektivt immobiliseres gennem vakuum-genereret suge i et specialiseret mikrokammer uden bedøvelse. Men denne metode tilbyder ikke høj tidsmæssig opløsning for cellebiologi undersøgelser, og det har strenge begrænsninger på dyrs størrelse10. En anden metode ved hjælp af en anæstesianordning opnået levende billeddannelse af Drosophila larver på flere tidspunkter og er blevet anvendt til at studere neuromuskulære vejkryds11,12,13,14,15,16. Men, denne metode heller ikke giver mulighed for kontinuerlig billeddannelse i længere end 30 min og kræver brug af desflurane gentagne gange, som kan hæmme neurale aktivitet og påvirke den biologiske proces undersøgt17,18. For nylig, en ny metode, der kombinerer mikrofluidic enhed og kryoanesthesi er blevet brugt til at immobilisere larver i forskellige størrelser i korte perioder (minutter)19. Denne metode kræver dog specialiserede anordninger såsom et kølesystem, og længere perioder med immobilisering kræver gentagen afkøling af larverne.
Her præsenterer vi en alsidig metode til immobilisering Drosophila larver, der er kompatibel med uafbrudt time-lapse billeddannelse i længere end 10 timer. Denne metode, som vi kalder “Larva Stabilisering af delvis vedhæftet fil” (LarvaSPA), indebærer at overholde larve neglebånd til en coverslip til billedbehandling i en specialbygget billedbehandling kammer. Denne protokol beskriver, hvordan man laver billedkammeret, og hvordan man monterer larver på en række udviklingsstadier. I LarvaSPA-metoden anbringes de ønskede kropssegmenter på dækstrækket ved hjælp af en UV-reaktiv lim. En PDMS cuboid desuden anvender pres på larverne, forhindrer flugt. Luft og fugt i billedkammeret sikrer overlevelsen af de delvist immobiliserede larver under billeddannelse. Fordele ved LarvaSPA i forhold til andre teknikker omfatter følgende: (1) Det er den første metode, der giver mulighed for kontinuerlig live imaging af intakte Drosophila larver i timevis med høj tidsmæssig og rumlig opløsning; (2) Metoden har færre begrænsninger for larvestørrelse; (3) Billedkammeret og PDMS-kuboider kan fremstilles til en minimal pris og kan genbruges.
Ud over at beskrive larve montering metode, giver vi flere eksempler på dens anvendelse til at studere dendrite udvikling og dendrite degeneration af Drosophila dendritic arborization (da) neuroner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi LarvaSPA, en alsidig metode til montering af levende Drosophila larver til langsigtet tidsforfaldsbilleddannelse. Denne metode kræver ikke genvinding eller genmontering af larver, hvilket muliggør uafbrudt billeddannelse. Det er derfor ideelt til sporing af biologiske processer, der tager timer at fuldføre, såsom dendrite degeneration og regenerering. Denne metode kan også bruges til billeddannelse intracellulære calcium dynamik og subcellulære begivenheder såsom microtubule vækst. Da l…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Lingfeng Tang for at etablere en tidligere version af LarvaSPA-metoden; Glenn Swan på Cornell Olin Hall Machine butik for at gøre tidligere prototyper af billedbehandling kammer; Philipp Isermann til fremstilling af metalrammer og forslag til fremstilling af PDMS cuboids; Cornell BRC Imaging facilitet for adgang til mikroskoper (finansieret af NIH tilskud S10OD018516); Maria Sapar for kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af en Cornell Fellowship tildelt HJ; en Cornell-startfond og NIH-tilskud (R01NS099125 og R21OD023824), der blev tildelt C.H.H.J. og C.H., udtænkte projektet og designede forsøgene. H.J. udførte eksperimenterne. H.J og C.H. skrev manuskriptet.
Materials
| 6061 Aluminum bars | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M double-sided tape | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Scotch Packaging tape | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
| DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| Glass coverslip | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 equipped with a resonant scanner | |
| Lens paper | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| Petri dishes (medium) | VWR | 25373-085 | |
| Petri dishes (small) | VWR | 10799-192 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| Rectangular petri dish | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| Transferring pipette | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | Refractive Index 1.56 |
| UV lamp (Workstar 2003) | Maxxeon | MXN02003 | |
| Vacuum desiccator | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
| Wipes | Kimberly-Clark | Kimwipes |
Riferimenti
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nature Neuroscience. 11 (6), 659-666 (2008).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
- Daniele, J. R., Baqri, R. M., Kunes, S. Analysis of axonal trafficking via a novel live-imaging technique reveals distinct hedgehog transport kinetics. Biology Open. 6 (5), 714-721 (2017).
- Csordas, G., et al. In vivo immunostaining of hemocyte compartments in Drosophila for live imaging. PLoS One. 9 (6), 98191 (2014).
- Han, C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Enhancer-driven membrane markers for analysis of nonautonomous mechanisms reveal neuron-glia interactions in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9673-9678 (2011).
- He, L., et al. Direction Selectivity in Drosophila Proprioceptors Requires the Mechanosensory Channel Tmc. Current Biology. 29 (6), 945-956 (2019).
- Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. The Journal of Neuroscience. 32 (36), 12460-12471 (2012).
- Vaadia, R. D., et al. Characterization of Proprioceptive System Dynamics in Behaving Drosophila Larvae Using High-Speed Volumetric Microscopy. Current Biology. 29 (6), 935-944 (2019).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 481-489 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 476-480 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of Drosophila larval neuromuscular junctions to study synapse assembly. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 407-413 (2012).
- Zhang, Y., et al. In vivo imaging of intact Drosophila larvae at sub-cellular resolution. Journal of Visualized Experiments. (43), e2249 (2010).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nature Protocols. 2 (12), 3285-3298 (2007).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 558, 489-502 (2004).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108 (3), 434-446 (2008).
- Chaudhury, A. R., et al. On chip cryo-anesthesia of Drosophila larvae for high resolution in vivo imaging applications. Lab on a Chip. 17 (13), 2303-2322 (2017).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Poe, A. R., et al. Dendritic space-filling requires a neuronal type-specific extracellular permissive signal in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (38), 8062-8071 (2017).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes, Development. 26 (14), 1612-1625 (2012).
- Stone, M. C., Albertson, R. M., Chen, L., Rolls, M. M. Dendrite injury triggers DLK-independent regeneration. Cell Reports. 6 (2), 247-253 (2014).
- Sapar, M. L., et al. Phosphatidylserine Externalization Results from and Causes Neurite Degeneration in Drosophila. Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Desjardins, M., et al. Awake Mouse Imaging: From Two-Photon Microscopy to Blood Oxygen Level-Dependent Functional Magnetic Resonance Imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
- Huang, C., et al. Long-term optical brain imaging in live adult fruit flies. Nature Communications. 9 (1), 872 (2018).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18739-18744 (2014).
