LarvaSPA, Eine Methode zur Montage von Drosophila Larva für Langzeit-Zeitraffer-Imaging
Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Montage von Drosophila-Larven, um länger als 10 h ununterbrochene Zeitraffer-Bildgebung bei intakten lebenden Tieren zu erreichen. Diese Methode kann verwendet werden, um viele biologische Prozesse in der Nähe der Larvenkörperwand abzubilden.
Abstract
Live Imaging ist ein wertvoller Ansatz zur Untersuchung zellbiologischer Fragen. Die Drosophila Larve eignet sich besonders für in vivo Live-Bildgebung, da die Larvenkörperwand und die meisten inneren Organe transparent sind. Die kontinuierliche Live-Bildgebung intakter Drosophila-Larven über 30 min war jedoch eine Herausforderung, da es schwierig ist, Larven lange Zeit nicht invasiv zu immobilisieren. Hier präsentieren wir eine Larvenmontagemethode namens LarvaSPA, die eine kontinuierliche Bildgebung von lebenden Drosophila-Larven mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung für länger als 10 Stunden ermöglicht. Bei diesem Verfahren werden Larven teilweise mit einem UV-reaktiven Kleber am Deckschein befestigt und zusätzlich die Larvenbewegung mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS)-Block zurückgeschraubt. Diese Methode ist mit Larven in Entwicklungsstadien vom zweiten Instar bis zum wandernden dritten Instern kompatibel. Wir zeigen Anwendungen dieser Methode bei der Untersuchung dynamischer Prozesse von Drosophila somatosensorischen Neuronen, einschließlich Dendritenwachstum und verletzungsinduzierter Dendritendegeneration. Diese Methode kann auch angewendet werden, um viele andere zelluläre Prozesse zu studieren, die in der Nähe der Larvenkörperwand passieren.
Introduction
Die Zeitraffer-Live-Bildgebung ist eine leistungsstarke Methode zur Untersuchung dynamischer zellulärer Prozesse. Die räumlichen und zeitlichen Informationen, die von Zeitrafferfilmen bereitgestellt werden, können wichtige Details für die Beantwortung zellbiologischer Fragen aufdecken. Die Drosophila Larve ist ein beliebtes In-vivo-Modell für Untersuchungen mit Live-Bildgebung, weil ihre transparente Körperwand eine nichtinvasive Bildgebung der inneren Strukturen1,2ermöglicht. Darüber hinaus stehen in Drosophila zahlreiche genetische Werkzeuge zur Fluoreszenz zur Kennzeichnung anatomischer Strukturen und Makromoleküle zur Verfügung3. Jedoch, langfristige Zeitraffer-Bildgebung von Drosophila Larven ist eine Herausforderung. Im Gegensatz zu stationären frühen Embryonen oder Pupas bewegen sich Drosophila-Larven ständig, was eine Immobilisierung für die Live-Bildgebung erforderlich macht. Effektive Möglichkeiten zur Immobilisierung lebender Drosophila-Larven umfassen die Montage in Halocarbonöl mit Chloroform4,anästhesieren mit Isofluran- oder Dichlorvos-Lösung5, und das Komprimieren zwischen dem Deckelrutsch und dem Mikroskopschlitten6. Obwohl einige dieser Methoden für die Mikroskopie verwendet wurden, keine von ihnen ist wirksam für langfristige Live-Bildgebung. Andere Methoden wurden für die Bildgebung von Körperwandneuronen in kriechenden Larven mittels konventioneller konfokaler Mikroskopie oder Lichtbogenmikroskopie7,8,9entwickelt. Diese Methoden sind jedoch nicht ideal für die Überwachung der zellulären Dynamik aufgrund der Bewegung der Larven.
Neue Methoden wurden entwickelt, um eine langfristige Zeitraffer-Bildgebung von Drosophila-Larven zu erreichen. Mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS) “Larvenchip” können Drosophila-Larven durch vakuumgenerierte Absaugung in einer spezialisierten Mikrokammer ohne Anästhesisierung effektiv immobilisiert werden. Diese Methode bietet jedoch keine hohe zeitliche Auflösung für zellbiologische Studien und hat strenge Einschränkungen für die Tiergröße10. Eine andere Methode mit einem Anästhesisierungsgerät erreicht Live-Bildgebung von Drosophila Larven an mehreren Zeitpunkten und wurde angewendet, um neuromuskuläre Knoten11,12,13,14,15,16. Diese Methode erlaubt jedoch auch keine kontinuierliche Bildgebung länger als 30 min und erfordert die wiederholte Verwendung von Desfluran, was die neuronale Aktivität hemmen und den untersuchten biologischen Prozess beeinflussen kann17,18. Kürzlich wurde eine neue Methode, die mikrofluidische Vorrichtung und Kryoanesthesie kombiniert, verwendet, um Larven verschiedener Größen für kurze Zeiträume (Minuten) zu immobilisieren19. Diese Methode erfordert jedoch spezielle Geräte wie ein Kühlsystem und längere Immobilisierungsphasen erfordern eine wiederholte Kühlung der Larven.
Hier präsentieren wir eine vielseitige Methode zur Immobilisierung von Drosophila-Larven, die mit ununterbrochener Zeitraffer-Bildgebung länger als 10 h kompatibel ist. Bei dieser Methode, die wir “Larvenstabilisierung durch Partielle Befestigung” (LarvaSPA) nennen, wird die Larvenhaut an einem Deckblatt für die Bildgebung in einer kundenspezifischen Bildgebungskammer anhaften. Dieses Protokoll beschreibt, wie man die Bildkammer macht und wie man Larven in einer Vielzahl von Entwicklungsstadien montiert. Bei der LarvaSPA-Methode werden die gewünschten Körpersegmente mit einem UV-reaktiven Kleber am Deckschein befestigt. Ein PDMS-Quader übt zusätzlich Druck auf die Larven aus und verhindert so das Entweichen. Die Luft und Feuchtigkeit in der Bildkammer sichern das Überleben der teilweise immobilisierten Larven während der Bildgebung. Vorteile von LarvaSPA gegenüber anderen Techniken sind die folgenden: (1) Es ist die erste Methode, die eine kontinuierliche Live-Bildgebung intakter Drosophila-Larven für Stunden mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung ermöglicht; (2) Die Methode hat weniger Beschränkungen für die Larvengröße; (3) Die Bildkammer und PDMS-Quader können zu minimalen Kosten hergestellt werden und sind wiederverwendbar.
Neben der Beschreibung der Larvenmontagemethode, bieten wir mehrere Beispiele für seine Anwendung für die Untersuchung der Dendritenentwicklung und Dendritendegeneration von Drosophila dendritischen Arborisation (da) Neuronen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir LarvaSPA, eine vielseitige Methode zur Montage lebender Drosophila-Larven für die Langzeit-Zeitraffer-Bildgebung. Diese Methode erfordert keine Wiederherstellung oder Wiedermontage von Larven, was eine unterbrechungsfreie Bildgebung ermöglicht. Es ist daher ideal für die Verfolgung biologischer Prozesse, die Stunden in Anspruch nehmen, wie Zerstitendegeneration und Regeneration. Diese Methode kann auch für die Bildgebung intrazellulärer Kalziumdynamik und subzelluläre Ereignisse wie Mi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Lingfeng Tang für die Einrichtung einer früheren Version der LarvaSPA-Methode; Glenn Swan von Cornell Olin Hall Machine Shop für frühere Prototypen der Bildgebungskammer; Philipp Isermann für den Bau von Metallrahmen und Vorschläge zur Herstellung von PDMS-Quadern; Cornell BRC Imaging-Anlage für den Zugang zu Mikroskopen (finanziert durch NIH-Zuschuss S10OD018516); Maria Sapar für die kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch ein Cornell Fellowship unterstützt, das H.J. verliehen wurde; ein Cornell-Start-up-Fonds und NIH-Stipendien (R01NS099125 und R21OD023824), die an C.H. H.J. und C.H. vergeben wurden, konzipierten das Projekt und entwarfen die Experimente. H.J. führte die Experimente durch. H.J. und C.H. schrieben das Manuskript.
Materials
| 6061 Aluminum bars | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M double-sided tape | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Scotch Packaging tape | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
| DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| Glass coverslip | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 equipped with a resonant scanner | |
| Lens paper | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| Petri dishes (medium) | VWR | 25373-085 | |
| Petri dishes (small) | VWR | 10799-192 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| Rectangular petri dish | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| Transferring pipette | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | Refractive Index 1.56 |
| UV lamp (Workstar 2003) | Maxxeon | MXN02003 | |
| Vacuum desiccator | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
| Wipes | Kimberly-Clark | Kimwipes |
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