LarvaSPA, Uzun Süreli Hızlandırılmış Görüntüleme için Drosophila Larva Montajı Için Bir Yöntem
Summary
Bu protokol, drosophila larvalarının sağlam canlı hayvanlarda 10 saatten daha uzun süre kesintisiz zaman atlamalı görüntüleme elde etmek için bir yöntem inşama yöntemini açıklamaktadır. Bu yöntem larva gövde duvarına yakın birçok biyolojik süreci görüntülemek için kullanılabilir.
Abstract
Canlı görüntüleme hücre biyolojisi sorularını araştırmak için değerli bir yaklaşımdır. Larva vücut duvarı ve iç organların çoğu saydam olduğu için Drosophila larvaözellikle in vivo canlı görüntüleme için uygundur. Ancak, 30 dakikadan uzun süre bozulmamış Drosophila larvalarının sürekli canlı görüntülemesi, invaziv olarak hareketsiz hale getirmek uzun süre larvaları hareketsiz hale getirmek zor olduğu için zor olmuştur. Burada larvaSPA adı verilen ve 10 saatten uzun süre yüksek temporal ve mekansal çözünürlüğe sahip canlı Drosophila larvalarının sürekli görüntülenmesine olanak tanıyan larvaspa adı verilen bir montaj yöntemi salıyoruz. Bu yöntem, uv-reaktif tutkal kullanarak coverslip’e kısmen larva takmayı ve ayrıca polidimethylsiloxane (PDMS) bloğu kullanarak larva hareketini kısıtlamayı içerir. Bu yöntem ikinci instar dan üçüncü instar wandering gelişim aşamalarında larvalar ile uyumludur. Drosophila somatosensoriyel nöronların dinamik süreçlerini incelerken bu yöntemin uygulamalarını gösteriyoruz, buna dendrit büyümesi ve yaralanmaya bağlı dendrit dejenerasyonu da dahil. Bu yöntem aynı zamanda larva gövde duvarı yakınında meydana gelen diğer birçok hücresel süreçleri incelemek için uygulanabilir.
Introduction
Hızlandırılmış canlı görüntüleme dinamik hücresel süreçleri incelemek için güçlü bir yöntemdir. Zaman atlamalı filmlerin sağladığı mekansal ve zamansal bilgiler hücre biyolojisi sorularını yanıtlamak için önemli ayrıntıları ortaya çıkarabilir. Şeffaf vücut duvarı iç yapıların noninvaziv görüntüleme için izin verir çünkü Drosophila larva canlı görüntüleme kullanarak araştırmalar için popüler bir in vivo modeli olmuştur1,2. Buna ek olarak, çok sayıda genetik araçlar Drosophila floresanca etiket anatomik yapılar ve makromoleküllermevcuttur 3. Ancak, Drosophila larvalarının uzun süreli hızlandırılmış görüntülemesi zordur. Sabit erken embriyolar veya pupa aksine, Drosophila larvaları sürekli hareket, canlı görüntüleme için immobilizasyon gerektiren. Canlı Drosophila larvaları hareketsizleştirmenin etkili yolları arasında kloroform4ile halokarbon yağımontajı, izofluran veya Dichlorvos solüsyonukullanılarakanestezi 5 , ve kapak kaymave mikroskop slayt ı arasında sıkıştırma6. Bu yöntemlerden bazıları mikroskopi için kullanılmış olsa da, bunların hiçbiri uzun süreli canlı görüntüleme de etkili değildir. Konvansiyonel konfokal mikroskopi veya ışık sayfası mikroskobu7,8,9kullanılarak tarama larvalarında vücut duvarı nöronlarının görüntülenmesi için başka yöntemler geliştirilmiştir. Ancak, bu yöntemler larvaların hareketi nedeniyle hücresel dinamikleri izlemek için ideal değildir.
Drosophila larvalarının uzun süreli hızlandırılmış görüntülemesini sağlamak için yeni yöntemler geliştirilmiştir. Bir polidimethylsiloxane kullanarak (PDMS) “larva çipi”, Drosophila larva etkili anestezi olmadan özel bir mikrohazret vakum üretilen emme yoluyla immobilize edilebilir. Ancak, bu yöntem hücre biyolojisi çalışmaları için yüksek zamansal çözünürlük sunmuyor ve hayvan boyutu üzerinde sıkı sınırlamalar vardır10. Bir anestezi cihazı kullanarak başka bir yöntem birden fazla zaman noktalarında Drosophila larvacanlı görüntüleme elde ve nöromüsküler kavşaklar 11 çalışma için uygulanmıştır11,12,13,14,15,16. Ancak, bu yöntem aynı zamanda 30 dakikadan daha uzun süre sürekli görüntüleme için izin vermez ve tekrar tekrar desfluran kullanarak gerektirir, hangi nöral aktiviteyi inhibe edebilir ve biyolojik süreci etkileyebilir17,18. Son zamanlarda, mikroakışkan cihaz ve kriyoanestezi birleştiren yeni bir yöntem kısa süreler için çeşitli boyutlarda larvaları hareketsiz leştirmek için kullanılmıştır (dakika)19. Ancak, bu yöntem bir soğutma sistemi ve immobilizasyon uzun süre lervalar tekrarlanan soğutma gerektirir gibi özel cihazlar gerektirir.
Burada 10 saatten daha uzun süre kesintisiz zaman atlamalı görüntüleme ile uyumlu Drosophila larvaları hareketsiz hale getirmenin çok yönlü bir yöntemini salıyoruz. “Kısmi Bağlanmaya Göre Larva Stabilizasyonu” (LarvaSPA) dediğimiz bu yöntem, larva miğanınözel olarak yapılmış bir görüntüleme odasında görüntüleme için bir kapak kaymasına yapıştırılmasını içerir. Bu protokol, görüntüleme odasının nasıl yapılacağını ve larvaların çeşitli gelişim evrelerinde nasıl monte edilebildiğini açıklar. LarvaSPA yönteminde, istenilen gövde segmentleri UV-reaktif tutkal kullanılarak kapak kaymasına yapıştırılır. Bir PDMS kübik ayrıca larvalara basınç uygulayarak kaçışı önler. Görüntüleme odasındaki hava ve nem, görüntüleme sırasında kısmen hareketsiz olan larvaların hayatta kalmasını sağlar. LarvaSPA’nın diğer tekniklere göre avantajları şunlardır: (1) Yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip, bozulmamış Drosophila larvalarının saatlerce sürekli canlı görüntülenmesine olanak sağlayan ilk yöntemdir; (2) Yöntemin larva boyutu üzerinde daha az sınırlaması vardır; (3) Görüntüleme odası ve PDMS kübikler en az maliyetle imal edilebilir ve yeniden kullanılabilir.
Larva montaj yöntemini tanımlamanın yanı sıra, Drosophila dendritik arborization (da) nöronlarının dendritgelişimi ve dendriter dejenerasyonu için uygulamanın birkaç örneğini savuruyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada LarvaSPA, uzun süreli hızlandırılmış görüntüleme için canlı Drosophila larvamontaj çok yönlü bir yöntem açıklar. Bu yöntem, larvaların kurtarılmasını veya yeniden monte edilmesini gerektirmez ve kesintisiz görüntüleme sağlar. Bu nedenle, dendrite dejenerasyonu ve rejenerasyon gibi tamamlanması saatler alan biyolojik süreçleri izlemek için idealdir. Bu yöntem aynı zamanda hücre içi kalsiyum dinamikleri ve mikrotübül büyümesi gibi hücre altı olayları görüntüleme i…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz LarvaSPA yönteminin önceki bir sürümünü kurmak için Lingfeng Tang teşekkür; Glenn Swan Cornell Olin Hall Machine mağazasında görüntüleme odasının önceki prototipleri yapmak için; Philipp Isermann metal çerçeveler inşa etmek ve PDMS kübik ler yapma konusunda öneriler sunmak için; Mikroskoplara erişim için Cornell BRC Görüntüleme tesisi (NIH hibe S10OD018516 tarafından finanse edilmektedir); Maria Sapar makalenin eleştirel okuması için. Bu çalışma, H.J.’e verilen Cornell Bursu ile desteklenmiştir; C.H.J. ve C.H.’ye verilen Bir Cornell başlangıç fonu ve NIH hibeleri (R01NS099125 ve R21OD023824) projeyi tasarladı ve deneyleri tasarladı. Deneyleri H.J. yaptı. Taslağı H.J. ve C.H. yazdı.
Materials
| 6061 Aluminum bars | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M double-sided tape | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Scotch Packaging tape | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
| DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| Glass coverslip | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 equipped with a resonant scanner | |
| Lens paper | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| Petri dishes (medium) | VWR | 25373-085 | |
| Petri dishes (small) | VWR | 10799-192 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| Rectangular petri dish | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| Transferring pipette | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | Refractive Index 1.56 |
| UV lamp (Workstar 2003) | Maxxeon | MXN02003 | |
| Vacuum desiccator | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
| Wipes | Kimberly-Clark | Kimwipes |
Riferimenti
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nature Neuroscience. 11 (6), 659-666 (2008).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
- Daniele, J. R., Baqri, R. M., Kunes, S. Analysis of axonal trafficking via a novel live-imaging technique reveals distinct hedgehog transport kinetics. Biology Open. 6 (5), 714-721 (2017).
- Csordas, G., et al. In vivo immunostaining of hemocyte compartments in Drosophila for live imaging. PLoS One. 9 (6), 98191 (2014).
- Han, C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Enhancer-driven membrane markers for analysis of nonautonomous mechanisms reveal neuron-glia interactions in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9673-9678 (2011).
- He, L., et al. Direction Selectivity in Drosophila Proprioceptors Requires the Mechanosensory Channel Tmc. Current Biology. 29 (6), 945-956 (2019).
- Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. The Journal of Neuroscience. 32 (36), 12460-12471 (2012).
- Vaadia, R. D., et al. Characterization of Proprioceptive System Dynamics in Behaving Drosophila Larvae Using High-Speed Volumetric Microscopy. Current Biology. 29 (6), 935-944 (2019).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 481-489 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 476-480 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of Drosophila larval neuromuscular junctions to study synapse assembly. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 407-413 (2012).
- Zhang, Y., et al. In vivo imaging of intact Drosophila larvae at sub-cellular resolution. Journal of Visualized Experiments. (43), e2249 (2010).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nature Protocols. 2 (12), 3285-3298 (2007).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 558, 489-502 (2004).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108 (3), 434-446 (2008).
- Chaudhury, A. R., et al. On chip cryo-anesthesia of Drosophila larvae for high resolution in vivo imaging applications. Lab on a Chip. 17 (13), 2303-2322 (2017).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Poe, A. R., et al. Dendritic space-filling requires a neuronal type-specific extracellular permissive signal in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (38), 8062-8071 (2017).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes, Development. 26 (14), 1612-1625 (2012).
- Stone, M. C., Albertson, R. M., Chen, L., Rolls, M. M. Dendrite injury triggers DLK-independent regeneration. Cell Reports. 6 (2), 247-253 (2014).
- Sapar, M. L., et al. Phosphatidylserine Externalization Results from and Causes Neurite Degeneration in Drosophila. Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Desjardins, M., et al. Awake Mouse Imaging: From Two-Photon Microscopy to Blood Oxygen Level-Dependent Functional Magnetic Resonance Imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
- Huang, C., et al. Long-term optical brain imaging in live adult fruit flies. Nature Communications. 9 (1), 872 (2018).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18739-18744 (2014).
