클로스트리디오이드 디피실을 위한 애벌레 제브라피쉬 감염 모델 개발
Summary
여기에 제시된 것은 미세 주입 및 비침습적 미세가브지에 의한 형광성 표지 혐기성 C. difficile로 얼룩말 유충을 감염하는 안전하고 효과적인 방법입니다.
Abstract
클로스트리디오이드 디피실 감염(CDI)은 미국에서 가장 흔한 의료 관련 위장 감염 중 하나로 간주됩니다. C. difficile에 대하여 타고난 면역 반응은 기술되었습니다, 그러나 CDI에 있는 호중구 및 대식세포의 정확한 역할은 보다 적게 이해됩니다. 현재 연구에서는, Danio rerio (zebrafish) 애벌레는 생체 내에서 이러한 선천적 면역 세포의 행동과 협력을 이미징하기 위한 C. difficile 감염 모델을 확립하는 데 사용됩니다. C. difficile을모니터링하기 위해 형광 염료를 사용하는 라벨링 프로토콜이 확립되었습니다. 국소화된 감염은 제브라피시 장관에서 활발하게 자라며 CDI의 장 상피 손상을 모방하는 C. difficile이라는 라벨이 붙은 마이크로주입에 의해 달성됩니다. 그러나, 이 직접적인 감염 프로토콜은 침략적이고 실험 결과에 영향을 미칠 수 있는 현미경 상처를 일으키는 원인이 됩니다. 따라서, 더 비침습적 마이크로게이지 프로토콜은 여기에 기술된다. 이 방법은 열린 입을 통해 삽관에 의해 제브라피시 유충의 장으로 직접 C. difficile 세포의 전달을 포함한다. 이 감염 방법은 C. difficile의자연 감염 경로를 밀접하게 모방합니다.
Introduction
C. difficile는 그람 양성, 포자 형성, 혐기성 및 위장관에서 의 심한 감염의 주요 원인인 독소 생성 간균1. CDI의 전형적인 현상은 설사, 복부 고통 및 치명적인 pseudomembranous 대장염을 포함하고, 때때로 죽음으로 이끌어 낼 수 있습니다1,2. 증거는 호스트 면역 반응이 이 질병의 진행 그리고 결과 둘 다에 있는 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었습니다3. 면역 반응 이외에, 토착 창자 microbiota는 CDI4의개시 그리고 병인을 위해 결정적이다. 지난 10 년 동안, CDI의 케이스의 수와 사망률은 C. difficile (BI/NAP1/027)의 hypervirulent 긴장의 출현 때문에 현저하게 증가했습니다5,6. 근본적인 면역 기계장치의 더 나은 이해 및 CDI 도중 microbiota의 역할은 이 전염병의 더 나은 통제를 가능하게 하는 새로운 치료 발달 및 어드밴스로 이끌어 낼 것입니다.
햄스터 및 마우스와 같은 몇몇 동물 모델은 C. difficile7,8에대하여 면역 방어에 대한 통찰력을 제공하기 위하여 개발되었습니다. 그러나, 선천성 면역 세포의 역할은 여전히 제대로 이해되지 못하며, 특히 선천성 면역 세포 행동은 주로 조직학적 분석 또는 시험관 내 배양 세포로부터 유래되기 때문에. 따라서, 살아있는 척추동물 유기체의 내부 C. difficile에 대한 선천적인 면역 반응을 밝히기 위해 투명한 제브라피시 모델을 확립하는 것은 그러한 연구를 용이하게 할 것이다. Zebrafish 유충은 기능성 선천성 면역 계통을 가지고 있지만, 수정 후 4-6주까지 적응면역계가결여되어 있다 9. 이 독특한 특징은 제브라피쉬 애벌레를 CDI에서 선천적인 면역 세포의 고립된 반응과 기능을 연구하는 훌륭한 모델로 만듭니다.
이 보고서는 대식세포와 호중구와 같은 C. difficile과 선천적인 면역 세포 사이의 상호 작용을 연구하기 위해 제브라피쉬 애벌레를 사용하는 새로운 방법을 설명합니다. 첫째, C. difficile 접종 및 염색을 포함하는 국소화된 미세 주입 프로토콜이 제시된다. 생체 내 공초점 시간 경과 이미징을 사용하여 감염 부위를 향한 호중구 및 대식세포의 반응이 기록되고 호중구 및 대식세포에 의한 박테리아의 식세포가 관찰됩니다. 그러나, 주사 자체가 조직 손상을 일으키고박테리아(10)와무관하게 백혈구의 모집을 유도하는 것으로 보고되었다. 따라서, 제브라피시 유충의 장으로 C. 디피실을 전달하는 비침습적 마이크로개지 프로토콜이 이어서 기술된다. 이전 연구는 토착 위장 미생물C. difficile의식민지에 대 한 호스트를 보호 하는 것을 입증했다 11. 따라서, 그놈제브라피쉬 유충은 또한 12개의감염된 제브라피시를 걸리기 위해 사용된다. 그 후, 장 해부는 실행 가능한 C. difficile을 복구하고 제브라피시 장관에서 자신의 존재의 기간을 확인하기 위해 수행됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제시된 방법은 주사 및 마이크로게이지10,14를모두 수행함으로써 제브라피시 유충을 감염시키기 위한 기존의 접근법을 수정하고 확장한다. 또한 제브라피시 유충22를사용하여 혐기성 병원체를 연구하는 접근법을 입증한다. 또한, 이 프로토콜은 CDI시 및 제브라피시에서 C. 디피실의 식민지화 시 생체 내 선천성 면역 세포 반응의 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 훌륭한 동물 관리를 위한 티모 프리치에게 감사드립니다. 우리는 Köster와 Steinert 연구소의 회원들에게 지원과 도움이 되는 토론에 감사드립니다. 원고를 비판적으로 읽어주신 한단 박사께 감사드립니다. 우리는 감사하 중 낮은 작센의 연방 국가에 의해 자금 을 인정, 니더샤치쉬 보랍 (VWZN2889).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | Ultra-low gelling agarose |
| Agarose low-melting (LM) | Pronadisa | 8050 | It is used in agarose plates |
| BacLight Red Bacterial Stain | Thermo Fisher Scientific | B35001 | Fluorescent dye |
| Brain-Heart-Infusion Broth | Carl Roth GmbH | X916.1 | |
| Brass (wild-type) | deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines | ||
| Calcium nitrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| Capillary Glass | Harvard Apparatus | 30-0019 | Injection needles |
| Clostridioides difficile | R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production | ||
| DMSO | Carl Roth GmbH | A994 | |
| FIJI | open-source platform | Image processing | |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 6763 | |
| Horizontal needle puller | Sutter instrument Inc | P-87 | |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | 168149 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Image processing | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | P026 | |
| Micro injector | eppendorf | 5253000017 | |
| Microinjection molds | Adaptive Science Tools | TU1 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | ||
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 5346 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265 | |
| Taurocholate | Carl Roth GmbH | 8149 | |
| Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils | ||
| Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages | ||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Yeast extract | BD Bacto | 212750 |
Riferimenti
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