전체 마운트 면역 조직 화학 및 3D 재건을 사용하여 인두 아치 동맥의 시각화 및 분석
Summary
여기서, 우리는 전체 마운트 면역 형광, 조직 정리, 공초점 현미경 및 3D 재건을 사용하여 마우스 배아의 인두 아치 동맥 3, 4 및 6을 시각화하고 분석하는 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
인두 아치 동맥의 부적절한 형성 또는 리모델링 (PAA) 3, 4, 6은 선천성 심장 질환의 가장 심각한 형태의 일부에 기여합니다. PAA의 형성을 연구하기 위하여는, 우리는 벤질 알콜/벤질 벤조에이트 (BABB) 조직 정리 및 공초점 현미경 검사법과 결합된 전체 마운트 면역 형광을 사용하여 프로토콜을 개발했습니다. 이를 통해 미세한 세포 해상도에서 인두 아치 내피의 시각화뿐만 아니라 혈관 구조의 3D 연결을 가능하게합니다. 소프트웨어를 사용하여 PAA의 내피 세포(EC)의 수와 인두 아치 내의 PA를 둘러싼 혈관 신경총 내의 EC 수를 정량화하는 프로토콜을 확립했습니다 3, 4 및 6. 전체 배아에 적용하면이 방법론은 배아 혈관 구조의 포괄적 인 시각화 및 정량 분석을 제공합니다.
Introduction
마우스 배아 발생 동안, 인두 아치 동맥 (PAA)은 등등 aortae1과심장을 연결하는 대칭, 이중 측면 동맥 쌍으로 발생합니다. 배아가 발달함에 따라, PAA의 제1 및 제2 쌍은 회귀하고,3rd,4th,및 6PAA는 대동맥 아치 동맥을 형성하기 위해 일련의 비대칭 리모델링 이벤트를 겪는다2.
PAA 3, 4 및 6은 혈관 형성을 통해 발전하며, 이는 혈관의 드노보형성인 3. 이러한 아치 동맥의 형성 또는 리모델링의 결함은 DiGeorge 증후군4,5환자에서 볼 수있는 것과 같은 다양한 선천성 심장 결함을 야기합니다. 그러므로, PAA의 발달을 통제하는 기계장치를 이해하는 것은 선천성 심장병 (CHD) 병인학의 더 나은 이해로 이끌어 낼 수 있습니다.
PAA 발달을 시각화하고 분석하기 위한 현재 접근법은 조직 단면도의 면역형광, 혈관 캐스트, 인도 잉크 주입, 고분해능 후피 현미경 검사법 및/또는 전체 마운트 면역조직화학1,,4,,5,,6,,7을포함한다. 본 명세서에서, 우리는 체적 데이터, 혈관 연결성 및 세포 정체성을 수집, 분석 및 정량화하기 위해 전체 마운트 면역형광, 공초점 현미경 및 3D 이미지 렌더링을 결합한 프로토콜을 설명한다. 또한, 우리는 인두 아치 의 형성과 PAA로의 리모델링을 연구하는 수단으로 각 인두 아치의 EC 수를 구획화하고 정량화하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 PAA 개발을 분석하기 위해 설계되었지만 다른 개발 혈관 네트워크를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
마우스 배아의 내피를 3D로 시각화하는 기능은 개발3에대한 새로운 통찰력을 제공했습니다. 여기에서 우리는 배아의 고해상도 3D 화상 진찰, 혈관 연결의 가시화 및 PAA 대형의 정량적인 분석을 허용하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 유전 적 변경 또는 환경 모욕이 PAA 개발에 미치는 영향을 확인하기 위해 사용될 수 있습니다. 여기에서 보고된 절차는 PAA 대형을 구상하?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 이 원고를 주의 깊게 읽고 편집해 주신 브리아나 알렉산더, 카올란 오도넬, 마이클 워칼라에게 감사드립니다. 이 작품은 NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01SA의 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소의 자금 지원; AJR은 NHLBI HL103920-08S1과 국립 관절염 및 근골격계 및 피부 질환 교육 교부금 T32052283-11에 의해 지원됩니다.
Materials
| 10x PBS | MP Biomedicals | PBS10X02 | |
| 20x water immersion objective | Nikon | MRD77200 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories | 1613101 | |
| Alexa Fluor 488 anti-goat | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Invitrogen | A-31570 | |
| Analysis Software | Imaris 9.2.0 | ||
| Benzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 305197 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma-Aldrich | 8.18701.0100 | |
| Cover Slips | VWR | 16004-312 | |
| DAPI (5 mg/mL stock) | Fisher Scientific | D3571 | |
| Eppendorf Tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| Ethanol | VWR | 89370-084 | |
| Falcon tubes (50 mL) | Corning | 352098 | |
| Fast wells | Grace Bio Labs | 664113 | |
| Forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Goat anti-VEGFR2 | R&D Systems, Inc. | AF644 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Microscope | Nikon | A1HD25 | |
| Mouse anti-ERG | Abcam | ab214341 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Petri dishes (35 mm) | Genesee Scientific | 32-103 | |
| Petri dishes (60 mm) | Genesee Scientific | 32-105 | |
| Plastic Molds | VWR | 18000-128 | |
| Scapels | Exelint International Co. | 29552 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP 151-500 |
Riferimenti
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