Essai combiné de formation conditionnelle et de formation de sphère adapté pour étudier un gène associé à la stemness des cellules souches du cancer gastrique dérivés par le patient
Summary
Dans ce protocole, nous présentons une conception expérimentale utilisant un système conditionnel d’effondrement et un essai adapté de formation de sphère pour étudier l’effet de la clusterine sur la tige des GCSE dérivés du patient. Le protocole peut être facilement adapté pour étudier la fonction in vitro et in vivo des gènes associés à la stemness dans différents types de CSC.
Abstract
Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont impliquées dans l’initiation, le développement et la récurrence des tumeurs après le traitement, et sont devenues le centre d’attention de nombreuses études au cours des dernières décennies. Par conséquent, il est important de développer des méthodes pour étudier le rôle des gènes clés impliqués dans la tige des cellules cancéreuses. Le cancer gastrique (GC) est l’un des types de cancers les plus courants et mortels. Les cellules souches du cancer gastrique (GCSC) sont considérées comme la racine de la rechute du cancer gastrique, des métastases et de la résistance aux médicaments. Comprendre la biologie des CSG est nécessaire pour faire progresser le développement de thérapies ciblées et éventuellement pour réduire la mortalité chez les patients. Dans ce protocole, nous présentons une conception expérimentale utilisant un système conditionnel d’effondrement et un essai adapté de formation de sphère pour étudier l’effet de la clusterine sur la tige des GCSE dérivés du patient. Le protocole peut être facilement adapté pour étudier la fonction in vitro et in vivo des gènes associés à la stemness dans différents types de CSC.
Introduction
Le cancer gastrique (GC) est l’un des types les plus communs et mortels de cancers1. Malgré les progrès de la chirurgie combinée, la chimiothérapie et la radiothérapie dans la thérapie GC, le pronostic reste faible et le taux de survie à cinq ans est encore très faible2. La récurrence et la métastase sont les principales raisons qui causent les décès post-traitement.
Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont un sous-ensemble de cellules cancéreuses qui possèdent la capacité de se renouveler et de générer les différentes lignées cellulaires qui reconstituent la tumeur3. On croit que les CSC sont responsables de la rechute et des métastases cancéreuses en raison de leurs capacités d’auto-renouvellement et d’ensemencement de nouvelles tumeurs, ainsi que leur résistance aux chimio et radiothérapies traditionnelles4. Par conséquent, le ciblage des CSC et l’élimination des CSC offrent un potentiel intéressant pour améliorer le traitement et réduire la mortalité des patients atteints de cancer.
Les CSC ont été isolés de nombreux types de tumeurs solides5. En 2009, les cellules souches du cancer gastrique (GCSC) isolées des lignées cellulaires du cancer gastrique humain ont été décrites à l’origine par Takaishi et coll.6. Chen et ses collègues ont d’abord identifié et purifié les GCSC à partir des tissus tumoraux gastriques humains (GAC)7. Ces résultats offrent non seulement l’occasion d’étudier la biologie des CSGC, mais ils confèrent également une grande importance clinique.
Une caractéristique particulière des CSC est leur capacité à former une sphère8. Les cellules simples sont plaquées dans des conditions nonadherentes à faible densité, et seules les cellules possédées avec l’auto-renouvellement peuvent se développer en un solide, cluster sphérique appelé une sphère. Ainsi, l’essai de formation de sphère a été considéré comme l’essai d’étalon-or et largement utilisé pour évaluer le potentiel d’auto-renouvellement des cellules souches in vitro.
L’interférence de l’ARN (RNAi) est un outil de recherche puissant pour étudier la fonction génique par l’effondrement d’un gène spécifique9. Cependant, les technologies stables à long terme de knockdown de gène ont certaines limitations, telles que le défi d’explorer la fonction d’un gène qui est essentiel pour la survie cellulaire. Les systèmes RNAi conditionnels peuvent être utiles pour la régulation des gènes désirés d’une manière temporelle et/ou spéciale contrôlée par l’administration d’un agent inducteur. Les systèmes inducibles de tétracycline (Tet) sont l’un des systèmes RNAi conditionnels les plus largement utilisés10. Les systèmes inducibles de Tet peuvent induire le silençage de gène cible en contrôlant l’expression de shRNA sur addition d’un inducteur exogène (préférentiellement doxycycline, Dox). Les systèmes tet-inductibles peuvent être divisés en deux types : les systèmes Tet-On ou Tet-Off. L’expression de shRNA peut être activée (Tet-On) ou désactivée (Tet-Off) en présence de l’inducteur. Dans le système Tet-ON sans inducteur, le répresseur tet (TetR) exprimé de façon constitutive se lie à la séquence de l’élément tet-responsible (TRE) contenant un promoteur dépendant du Tet-responsive Pol III pour l’expression shRNA, réprimant ainsi l’expression du shRNA. Tandis qu’à l’ajout de Dox, le TetR est séquestré loin du promoteur Tet-responsive Pol III-dépendant. Cela facilite l’expression de l’ARSh et conduit à l’effondrement des gènes.
Le protocole décrit ici utilise un système de shRNA fonctionnel tétracycline-inductible et un essai de formation de sphère adapté pour étudier la fonction de clusterine dans les GCSC dérivés du patient. Clusterin a été identifié comme une nouvelle molécule clé pour maintenir la stemness et la survie des GCSCs dans une étude précédente11. Nous utilisons le protocole décrit pour étudier les effets de la clusterine dans l’auto-renouvellement des GCSE. Cette méthodologie s’applique également à d’autres types de cellules souches cancéreuses.
Protocol
Representative Results
Discussion
GC est la troisième cause de décès lié au cancer dans le monde. Les CSGC sont essentiels dans la rechute du cancer gastrique, la métastase et la résistance aux médicaments. L’utilisation des GCSE de patients atteints de cancer gastrique nous permettra d’explorer leur point faible et de développer les médicaments de ciblage pour le traitement des patients gc.
L’essai de formation de sphère est une méthode utile pour examiner le potentiel d’auto-renouvellement des cellules sou…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par la Nature Science Foundation of Guangdong Province (2018A030310586, 2020A1515010989), la Medical Scientific Research Foundation de la province du Guangdong (A2019405), la National Natural Science Foundation of China (81772957), la Science et le programme technologique de la province du Guangdong en Chine (2017B030301016), et la Fondation de l’industrie et des technologies de l’information de Shenzhen (20180309100135860).
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 2068586 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3474 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate | Gibco | 10569044 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Australia | Gibco | 10099141 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X | Gibco | 41400045 | |
| lentiviral vector | GeneChem | GV307 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | 631232 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000015 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Gibco | 11140050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RB | |
| Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes | Thermo Scientific | 5000-1020 | |
| Nunc Cell Culture/Petri Dishes | Thermo Scientific | 171099 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| pHelper 1.0 (gag/pol component) | GeneChem | pHelper 1.0 | |
| pHelper 2.0 (VSVG component) | GeneChem | pHelper 2.0 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium | ZENOAQ | 11890 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Solution | Gibco | A1110501 | |
| UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| ZEISS Inverted Microscope | ZEISS | Axio Vert.A1 |
Riferimenti
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