Kombineret betinget knockdown og tilpasset sfære dannelse assay at studere en stemness-associerede gene af patient-afledte gastrisk kræft stamceller

Summary

I denne protokol præsenterer vi et eksperimentelt design ved hjælp af et betinget knockdown-system og en tilpasset kugledannelsesanalyse for at undersøge klyngeins indvirkning på stænglen af patientudledte GCSE’er. Protokollen kan let tilpasses til at studere både in vitro og in vivo funktion af stængel-associerede gener i forskellige typer af CSC’er.

Abstract

Kræft stamceller (CSCs) er impliceret i tumor indledning, udvikling og tilbagefald efter behandling, og er blevet centrum for opmærksomhed i mange undersøgelser i de sidste årtier. Derfor er det vigtigt at udvikle metoder til at undersøge den rolle, som centrale gener, der er involveret i kræftcelle stamtætighed. Gastrisk kræft (GC) er en af de mest almindelige og dødelige typer af kræft. Gastrisk kræft stamceller (GCSCs) menes at være roden til mavekræft tilbagefald, metastase og resistens over for lægemidler. Forståelse GCS biologi er nødvendig for at fremme udviklingen af målrettede behandlinger og i sidste ende at reducere dødeligheden blandt patienter. I denne protokol præsenterer vi et eksperimentelt design ved hjælp af et betinget knockdown-system og en tilpasset kugledannelsesanalyse for at undersøge klyngeins indvirkning på stænglen af patientudledte GCSE’er. Protokollen kan let tilpasses til at studere både in vitro og in vivo funktion af stængel-associerede gener i forskellige typer af CSC’er.

Introduction

Gastrisk kræft (GC) er en af de mest almindelige og dødelige typer af kræft¹. På trods af fremskridt inden for kombineret kirurgi, kemoterapi og strålebehandling i GC terapi, prognose er fortsat dårlig, og de fem-årige overlevelsesraten er stadig meget lav². Gentagelse og metastase er de vigtigste årsager til dødsfald efter behandlingen.

Kræft stamceller (CSCs) er en delmængde af kræftceller, der besidder evnen til selv at forny og generere de forskellige celle slægter, der rekonstituere^{tumoren 3}. CSCs menes at være ansvarlig for kræft tilbagefald og metastase på grund af deres evne til selvfornyelse og såning nye tumorer, samt deres modstand mod traditionelle kemo- og^{radioterapier 4}. Derfor giver målretning af CSC’er og eliminering af CSC’er et spændende potentiale til at forbedre behandlingen og reducere dødeligheden hos kræftpatienter.

CSC’er er blevet isoleret fra mange typer af faste tumorer⁵. I 2009, gastriskkræft stamceller (GCSCs) isoleret fra human gastrisk kræft cellelinjer blev oprindeligt beskrevet af Takaishi et al.⁶. Chen og kolleger først identificeret og renset GCSE fra humane gastrisk adenocarcinom (GAC) tumorvæv⁷. Disse resultater giver ikke kun mulighed for at studere GCS’s biologi, men giver også stor klinisk betydning.

Et særligt kendetegn ved CSC’er er deres evne til at danne en^{sfære 8}. Enkelte celler er belagt i ikke-vedhæftige forhold ved lav tæthed, og kun de celler, der besiddes med selvfornyelse, kan vokse til en fast, sfærisk klynge kaldet en kugle. Således kuglen dannelse assay er blevet betragtet som guld standard assay og bredt anvendt til at evaluere stamceller selvfornyelse potentiale in vitro.

RNA interferens (RNAi) er et effektivt forskningsværktøj til at studere genfunktion ved knockdown af et bestemt gen⁹. Men, langsigtede stabile gen knockdown teknologier har visse begrænsninger, såsom den udfordring at udforske funktionen af et gen, der er afgørende for celle overlevelse. Betinget RNAi-systemer kan være nyttige for nedregulering af ønskede gener på en tidsmæssig og/eller særlig kontrolleret måde ved administration af et inducerende middel. Tetracyclin (Tet)-inducerende systemer er et af de mest udbredte betingede RNAi-systemer¹⁰. De Tet-inducerende systemer kan fremkalde målgenhæmning ved at kontrollere ekspressionen af shRNA ved tilsætning af en eksogen inducer (fortrinsvis doxycyclin, Dox). De Tet-inducerende systemer kan opdeles i to typer: Tet-On eller Tet-Off systemer. Udtrykket af shRNA kan tændes (Tet-On) eller slukkes (Tet-Off) i tilstedeværelse af induceren. I Tet-ON-systemet uden en inducer binder det konstituerende udtrykte Tet repressor (TetR) sig til Tet-responsive element (TRE) sekvensen, der indeholder en Tet-responsive Pol III-afhængig promotor for shRNA-udtryk, hvilket undertrykker udtrykket af shRNA. Mens der ved tilsætning af Dox, er TetR afsondret væk fra Tet-responsive Pol III-afhængige promotor. Dette letter udtryk for shRNA og fører til gen knockdown.

Den protokol, der er beskrevet her, anvender et funktionelt tetracyclin-induceret shRNA-system og en tilpasset kugledannelsesanalyse til undersøgelse af funktionen af clusterin i patientudledte GCSCs. Clusterin er blevet identificeret som et nyt nøglemolekyle til opretholdelse af GCSCs’ stænglers stilk og overlevelse i en tidligere undersøgelse¹¹. Vi bruger den beskrevne protokol til at undersøge virkningerne af clusterin i GCSE’er selvfornyelse. Denne metode gælder også for andre typer kræftstamceller.

Protocol

Alle forsøg med patientafledte mavekræftstastastaceller, der er beskrevet heri, blev godkendt af det lokale etiske udvalg7. 1. Gastrisk kræft stamcellekultur Udarbejdelse af GCSE’er komplet kulturmedium Forbered GCS komplet kultur medium ved at tilføje frisk DME/F12 medium med følgende væsentlige ingredienser: 20 ng/ ml EGF, 10 ng / ml bFGF, 1% Insulin / Transferrin / Natrium selent, 0,2% glukose, 0,5% B27, 1% Glutamax, 1% ikke-essentiel aminosyr…

Representative Results

Gastrisk kræft stamceller fra primær menneskelige gastrisk adenocarcinom blev dyrket i serum-fri kultur medium. Efter 6 dage, celler udvidet fra en enkelt celle-lignende fænotype (Figur 1A) til at danne store kugler (Figur 1B). For at vurdere funktionen af clusterin i GCSC’er blev shRNA-sekvenser mod clusterin og krypteret klonet til…

Discussion

GC er den tredje hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan. GCSCs er kritiske i mavekræft tilbagefald, metastase og resistens over for lægemidler. Brug af GCS fra gastrisk kræftpatienter vil give os mulighed for at udforske deres svage punkt og udvikle målretning medicin til behandling af GC patienter.

Kuglen dannelse assay er en nyttig metode til at undersøge kræft stamceller selvfornyelse potentiale in vitro. Resultaterne kan præsenteres som procentdelen af kugl…

Materials

0.22 μm filter	Millipore	SLGP033RB
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145
2-Mercaptoethanol	Gibco	2068586
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Sigma-Aldrich	CLS3474
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10228
Countess II Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G6152
DMEM/F-12, HEPES	Gibco	11330032
DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate	Gibco	10569044
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190250
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia	Gibco	10099141
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061
Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X	Gibco	41400045
lentiviral vector	GeneChem	GV307
Lenti-X Concentrator	Takara	631232
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Invitrogen	L3000015
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X	Gibco	11140050
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized	Millipore	SLHV033RB
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes	Thermo Scientific	5000-1020
Nunc Cell Culture/Petri Dishes	Thermo Scientific	171099
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Gibco	15140122
pHelper 1.0 (gag/pol component)	GeneChem	pHelper 1.0
pHelper 2.0 (VSVG component)	GeneChem	pHelper 2.0
Polybrene	Sigma-Aldrich	H9268
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium	ZENOAQ	11890
StemPro Accutase Cell Dissociation Solution	Gibco	A1110501
UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5	Invitrogen	15567027
ZEISS Inverted Microscope	ZEISS	Axio Vert.A1