Descriviamo un metodo di colorazione rapida per eseguire l'imaging multispettrale sui tessuti congelati.
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Articolo metodologico
Un metodo rapido per l'imaging della fluorescenza multispettrale delle sezioni dei tessuti congelati
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'imaging a fluorescenza multispettrale su tessuti incorporati in paraffina fissata in formalina (FFPE) consente di rilevare più marcatori in un singolo campione di tessuto in grado di fornire informazioni sulla coespressione dell'antigene e sulla distribuzione spaziale dei marcatori. Tuttavia, la mancanza di anticorpi adatti per i tessuti fissati in formalina può limitare la natura dei marcatori che possono essere rilevati. Inoltre, il metodo di colorazione richiede molto tempo. Qui descriviamo un metodo rapido per eseguire l'imaging a fluorescenza multispettrale sui tessuti congelati. Il metodo include le combinazioni di fluoroforo utilizzate, passaggi dettagliati per la colorazione dei tessuti congelati del topo e dell'uomo e le procedure di scansione, acquisizione e analisi. Per l'analisi della colorazione, viene utilizzato un sistema di imaging a fluorescenza multispettrale semiautomatico disponibile in commercio. Attraverso questo metodo, fino a sei diversi marcatori sono stati macchiati e rilevati in una singola sezione di tessuto congelato. Il software di analisi dell'apprendimento automatico può fenotipo le cellule che possono essere utilizzate per l'analisi quantitativa. Il metodo qui descritto per i tessuti congelati è utile per il rilevamento di marcatori che non possono essere rilevati nei tessuti FFPE o per i quali anticorpi non sono disponibili per i tessuti FFPE.
Introduzione
I recenti progressi nelle tecniche di imaging microscopico hanno migliorato significativamente le nostre conoscenze e la comprensione dei processi biologici e degli stati della malattia. Il rilevamento in situ delle proteine nei tessuti tramite immunohistochimica cromogenica (IHC) viene regolarmente eseguito in patologia. Tuttavia, il rilevamento di più marcatori che utilizzano la colorazione IHC cromogenica è difficile1 e metodi più recenti per utilizzare approcci di colorazione multifluorescenza (mIF), in cui più marcatori biologici sono etichettati su un singolo campione di tessuto, sono in fase di sviluppo. La rilevazione di più marcatori b....
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Protocollo
La milza del topo e i tessuti tumorali del topo HLF1623 sono stati ottenuti dal nostro laboratorio. Il tessuto tonsillare umano è stato acquistato da un fornitore commerciale. I dettagli sono forniti nella Tabella dei Materiali.
1. Incorporamento dei tessuti
- Incorporare tessuti freschi nella soluzione OCT (temperatura di taglio ottimale) e congelare con lo snap utilizzando ghiaccio secco o azoto liquido.
- Conservare i tessuti a -80 gradi centigradi.
2. Criosezione
- Tagliare 8 sezioni in un criostato con temperature fissate a -25 gradi cent....
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Risultati
Rilevamento di marcatori a macchia singola su sezioni di milza congelate
Poiché il sistema di imaging semiautomatico utilizza un sistema di filtri regolabili a cristalli liquidi (LCTF) che consente una più ampia gamma di rilevamento della lunghezza d'onda25, e poiché non sono stati eseguiti passaggi di amplificazione del segnale qui, abbiamo prima ottimizzato il rilevamento dei nostri anticorpi coniugati primari per ogni marcatore al microscopio. Un esempio è illustrato nella <.......
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Discussione
I tessuti congelati sono stati ampiamente utilizzati per l'imaging mIF per rilevare tradizionalmente da tre a quattro marcatori31 su un tessuto utilizzando il metodo diretto e indiretto32. Nel metodo diretto, gli anticorpi sono coniugati a coloranti fluorescenti o punti quantici33 per etichettare il tessuto, mentre nel metodo indiretto, un anticorpo primario non coniugato viene utilizzato per etichettare il tessuto seguito da un anticorpo secondario .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
L'imaging e l'analisi sono state fornite dal Research Resources Center – Research Histology and Tissue Imaging Core dell'Università dell'Illinois a Chicago istituito con il supporto dell'ufficio del Vice Cancelliere per la Ricerca. Il lavoro è stato supportato da NIH/NCI RO1CA191317 a CLP, da NIH/NIAMS (SBDRC grant 1P30AR075049-01) al Dr. A. Paller, e dal sostegno del Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center to the Immunotherapy Assessment Core presso la Northwestern University.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acetone (grado istologico) | Fisher Scientific | A16F-1GAL | Tessuti di fissaggio |
| Alexa Fluor 488 anti-topo CD3 | BioLegend | 100212 | Clone - 17A2; anticorpo coniugato primario |
| Alexa Fluor 488, eBioscience anti-umano CD20 | ThermoFisher Scientific | 53-0202-82 | Clone - L26; anticorpo coniugato primario |
| Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 | BD Biosciences | 558617 | Anticorpo coniugato primario |
| Alexa Fluor 594 anti-umano CD3 | BioLegend | 300446 | Clone - UCHT1; anticorpo coniugato primario |
| Alexa Fluor 594 anti-topo CD8a | BioLegend | 100758 | Clone - 53-6.7; anticorpo coniugato primario |
| Alexa Fluor 647 anti-umano CD8a | BioLegend | 372906 | Clone - C8/144B; anticorpo |
| coniugato primarioAlexa Fluor 647 anti-topo CD206 (MMR) | BioLegend | 141711 | Clone - C068C2; anticorpo coniugato primario |
| Alexa Fluor 647 anti-topo CD4 Anticorpo | BioLegend | 100426 | Clone - GK1.5; anticorpo coniugato primario |
| C57BL/6 Mouse | Charles River Laboratories | 27 | Tessuti congelati di topo utilizzati per il training multispettrale |
| Coplin Jar | Sigma Aldrich | S6016-6EA | Vetrini reidratanti e lavanti Soluzione |
| DAPI | BD Biosciences | 564907 | Colorazione dell'acido nucleico |
| Vetrini caricati Vetro bianco diamantato Vetrini caricati | DOT Scientific | DW7590W | Sezioni di tessuto aderenti |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco 1x (senza Ca e Mg) | Fisher Scientific | MT21031CV Lavaggio e diluente | |
| Gold Seal Cover Slips | ThermoFisher Scientific | 3306 | Protezione dei tessuti colorati |
| Tonsilla normale umana OCT blocco di tessuto congelato | AMSBio | AMS6023 | Tessuto umano congelato utilizzato per la colorazione multispettrale |
| Siero umano 1x | Gemini Bio-Products | 100-512 | Bloccante e diluente per tessuti umani |
| inForm | Akoya Biosciences | Versione 2.4.1 | Software di apprendimento automatico |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-umano CD4 | BioLegend | 300529 | Clone - RPA-T4; anticorpo coniugato primario |
| PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 550993 | Clone - M1/70; anticorpo coniugato primario |
| Phenochart | Akoya Biosciences | Versione 1.0.8 | Software di scansione dell'intero vetrino |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36965 | Mezzo |
| di montaggioRicerca Criostato | Leica Biosystems | CM3050 S | Sezionamento dei tessuti |
| Superblock 1x | ThermoFisher Scientific | 37515 | Blocco dei tessuti di topo |
| Soluzione Tissue-Tek O.C.T | Sakura Finetek | 4583 | Inclusione dei tessuti |
| Vectra 3.0 Sistema automatizzato di imaging patologico quantitativo, 6 vetrini | Akoya Biosciences | CLS142568 | Imaging multispettrale semi-automatizzato sistema |
| Vectra Software | Akoya Biosciences | Versione 3.0.5 | Software per l'utilizzo del microscopio |
Riferimenti
- van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33 (1), 31-40 (2010).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C.
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Ristampe e permessi
