歯髄パラクリン信号に反応した神経突起の成長を研究する共培養法
Summary
我々は、トランスウェルフィルター上に培養された三叉(TG)ニューロンを用いた歯科パルプ(DP)一次細胞の分離、分散およびめっきについて述べた。DP細胞の細胞応答は、免疫蛍光またはRNA/タンパク質分析で分析することができる。共焦点顕微鏡を用いた神経細胞マーカーの免疫蛍光は、神経突起の成長応答の解析を可能にする。
Abstract
歯のインナーブは、歯の内部が圧力、温度および炎症を感知することを可能にし、そのすべてが歯器官の使用および維持にとって重要である。感覚的な内膜がなければ、毎日の口腔活動は回復不可能な損傷を引き起こすであろう。その重要性にもかかわらず、歯の発達と維持における内膜の役割はほとんど見過ごされてきた。いくつかの研究は、DP細胞がTG軸索を引き付け、歯全体に導くために細胞外マトリックスタンパク質およびパラクリンシグナルを分泌することを実証している。しかし、DP間質と神経の薬効との間のクロストークに関する詳細な洞察を提供した研究はほとんどありません。この知識のギャップに対処するために、研究者は共文化と様々な技術を活用してこれらの相互作用を調査し始めました。ここでは、大口径の細孔を有するトランスウェルフィルターに分散したTGニューロンを用いて一次DP細胞を共培養し、細孔を通して軸索成長を可能にする複数のステップを実証する。loxP部位によって隣接した目的の遺伝子を有する原発性DP細胞は、アデノウイルス-Cre-GFPリコンビナーゼ系を用いて遺伝子欠失を促進するために利用された。Thy1-YFPマウスのTGニューロンを使用すると、共焦点顕微鏡によるバックグラウンドレベルをはるかに上回る発現を有する正確なアフェレントイメージングが可能となった。DP応答は、取り外し可能なガラスカバースリップにメッキされたDP細胞の免疫蛍光染色を介して、タンパク質またはRNAの収集および分析、または代替的に調査することができる。培地はプロテオーム分析などの手法を用いて分析できますが、これはウシ胎児血清の存在によるアルブミンの枯渇を必要とします。このプロトコルは、共培養アッセイの制御された環境に応答して、TGニューロンおよびDP細胞の形態学的、遺伝的、および細胞骨格応答を研究するために操作することができる簡単な方法を提供する。
Introduction
歯のインナーブは、歯の内部が圧力、温度および炎症を感知することを可能にし、そのすべてが歯器官の使用および維持にとって重要である。虫歯や外傷に伴う歯の痛みを感知しないと、病気の進行につながります。したがって、適切な内線は、正常な歯の成長、機能およびケアのための要件である。
ほとんどの臓器は出生時までに完全に機能し、内臓化されていますが、歯の発達は成人生活にまで及び、出生後段階1、2の間に協調して歯の内膜とミネラル化が起こる。興味深いことに、歯髄(DP)間感覚は、最初は胚発生時に反発シグナルを分泌し、発達中の歯器官への軸索の侵入を防ぎ、後に歯が噴火に近づくにつれて誘引因子の分泌に移行する3,4。出生後の段階では、象牙質沈着が始まる頃に歯牙(TG)神経から逸脱した軸索が歯に浸透する(Pagella,P.いくつかの生体内研究では、神経間葉相互作用がマウスの歯の内膜化を導く(Luukko,K.al.
細胞共培養は、研究者が神経集団と間葉集団間の相互作用を操作できる制御された環境を提供する。共培養実験により、歯のインナーブと発達を導くシグナル伝達経路をより深く掘り下げることができます。しかし、いくつかの従来の方法は、共培養で細胞を研究するために使用される技術的な課題を提示する。例えば、ニューライトの結晶バイオレット染色は、TGバンドル分散液に含まれるシュワン細胞を非特異的に染色することができ、また、比較的小さな応答で色強度のピークが7に有する可能性がある。マイクロ流体室は魅力的なオプションを提供しますが、トランスウェルフィルタ8、9よりもかなり高価であり、DP分泌物に対する神経応答の調査のみを許可します。これらの問題に対処するために、a)DP分泌物に応答したTG神経突起の正確な染色およびイメージング、b)DP細胞および/またはTGニューロンの遺伝子改変による特定のシグナル経路の調査、およびc)TGニューロンによって分泌された因子に対するDP細胞応答の調査を可能にするプロトコルを開発した。このプロトコルは、in vitro共培養アッセイの制御された環境における歯のインナーブの複数の特徴を正確に調査する能力を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
口腔の日々の活動は、歯が適切な使用と維持を可能にするために外的刺激と内部炎症を感知することを必要とする。しかし、歯の内膜の発達過程を促進する信号に関する情報は限られています。このプロトコルは、2つの集団間の相互通信を研究するために、プライマリDP細胞およびTGニューロンを分離および共培養する方法を提供する。いくつかの変数が最適化され、以下に説明されるよう?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、a)国立衛生研究所/NIAMS(助成金番号R01 AR062507とR01 AR053860からRSへ)、b)アラバマ大学バーミンガム歯科学術研究トレーニング(DART)助成金(番号T90DE022736(PI MacDougall))によって、国立歯科・頭蓋顔面研究研究所/クリオフェイシャル研究研究所/SBPに支援されました。 c) UABグローバル・センター・フォー・クラニオ顔面・口腔・歯科障害センター(GC-CODED)パイロットおよびD)国立歯科頭蓋顔面研究所SBPに対する研究/国立衛生研究所K99 DE024406助成金。
Materials
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503 | Used as a mitotic Inhibitor at 15 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| 24 Well Cell Culture Plate | Corning | 3524 | Co-culture plate |
| Alexa-546 anti-chicken | Invitrogen | A-11040 | Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution |
| Anti-GFP Antibody | Aves Lab, Inc | GFP-1010 | Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution |
| Anti-Neurofilament 200 antibody | Sigma-Aldrich | NO142 | Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available |
| B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J | The Jackson Laboratory | 12603 | Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol |
| B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J | The Jackson Laboratory | 3709 | Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons |
| Collagenase Type II | Millipore | 234155-100MG | Used to disperse trigeminal neurons |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437 | Additive to co-culture media |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | Fine forceps for TG dissection |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Coats the transwell inserts at final concentration of 10 μg/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml |
| Lysis Buffer (Buffer RLT) | Qiagen | 79216 | Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Additive to co-culture media |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | Dissection scissors to open skull |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-545-81 | Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing |
| Minimal Essential Medium a | Gibco | 12571063 | Co-culture media base |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | Antibiotic additive to co-culture media |
| Phosphatase Inhibitor | Sigma-Aldrich | 04 906 837 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Used to aid in dental pulp cell transfection |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion |
| Protease Inhibitors | Millipore | 05 892 791 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| RNAse/DNAse free eppendorf tubes | Denville | C-2172 | Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay |
| ThinCert Cell Culture Insert | Greiner Bio-One | 662631 | Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Used fto disperse dental pulp cells |
| Trypsin Type II | Sigma-Aldrich | T-7409 | Used to disperse trigeminal neurons |
| Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | Ultra fine forceps for dissection |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | Used as a mitotic Inhibitor at 1 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| Vacuum Filtration System | Millipore | SCNY00060 | Steriflip disposable filter, 50 μm nylon net filter |
| Vial forceps | Fine Science Tools | 110006-15 | Long forceps for tissue transfer to conicals |
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