JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Immunologia e infezioni

Måling Erythrocyt Supplement Receptor 1 Brug Flow cytometri

Published: May 19, 2020
doi:
10.3791/60810
, , , , ,
1Oncogeriatric Coordination Unit,Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 2Faculty of Medicine,University of Reims Champagne-Ardenne, 3URCACyt, Flow cytometry technical platform,University of Reims Champagne-Ardenne, 4Department of Immunology,Reims University Hospitals, Robert Debre Hospital, 5Department of Internal Medicine and Geriatrics,Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 6Faculty of Medicine,University of Reims Champagne-Ardenne

Summary

Formålet med denne metode er at bestemme CR1-tætheden i erythrocytter af ethvert forsøgsperson ved at sammenligne med tre forsøgspersoner, hvis erythrocyt CR1-tæthed er kendt. Metoden anvender flowcytometri efter immunfarvning af forsøgspersonernes erythrocytter med et anti-CR1 monoklonalt antistof koblet til et forstærket system ved hjælp af phycoerythrin (PE).

Abstract

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) er en høj molekylvægt membran glycoprotein på omkring 200 kDa, der styrer supplement aktivering, transporterer immun komplekser, og deltager i humoral og cellulære immunrespons. CR1 er til stede på overfladen af mange celletyper, herunder erythrocytter, og udviser polymorfier i længde, struktur (Knops, eller KN, blodtype), og tæthed. Den gennemsnitlige massefylde af CR1 pr. erythrocyt (CR1/E) er 500 molekyler pr. erythrocyt. Denne tæthed varierer fra individ til individ (100-1.200 CR1/E) og fra en erythrocyt til en anden i samme person. Vi præsenterer her en robust flow cytometri metode til at måle tætheden af CR1/E, herunder i forsøgspersoner, der udtrykker en lav tæthed, ved hjælp af en forstærkende immunfarvning system. Denne metode har gjort det muligt for os at vise sænkning af CR1 erythrocyt udtryk i sygdomme som Alzheimers sygdom (AD), systemisk lupus erythematosus (SLE), AIDS, eller malaria.

Introduction

CR1 (supplement receptor type 1, CD35) er en 200 kDa transmembrane glycoprotein til stede på overfladen af mange celletyper, såsom erythrocytter1, B lymfocytter2, monocytiske celler, nogle T-celler, follikulære dendritiske celler3, føtale astrocytter4, og glomerular podocytter5. CR1 forstyrrer dens ligander C3b, C4b, C3bi6,,7,8,9, en underenhed af den første komplementkomponent, C1q10 og MBL (mannan-bindende lectin)11 hæmmer aktivering af komplemente og er involveret i humoral og cellulær immunrespons.

Hos primater, herunder mennesker, erythrocyt CR1 involveret i transport af immunkomplekser til leveren og milten, at rense blodet og forhindre deres ophobning i sårbare væv såsom hud eller nyrer12,13,14. Dette fænomen af immun vedhæfte mellem immun komplekser og erythrocytter afhænger af antallet af CR1 molekyler15. Hos mennesker er den gennemsnitlige massefylde af CR1/E kun 500 (dvs. 500 cr1-molekyler pr. erythrocyt). Denne tæthed varierer fra individ til individ (100-1.200 CR1/E) og fra en erythrocyt til en anden i samme person. Nogle personer af “null” fænotype udtrykker færre end 20 CR1/E16.

Tætheden af CR1/E reguleres af to meddominerende autosomaller, der er forbundet med en punktmutation i intron 27 af genkoden for CR1*117,18. Denne mutation producerer et ekstra restriktionssted for HindIII-enzymet. De restriktionsfragmenter, der er opnået efter fordøjelsen med HindIII i dette tilfælde, er 7,4 kb for allel, der er forbundet med et stærkt udtryk for CR1 (H: høj allel) og 6,9 kb for allelen, der er forbundet med lavt CR1-udtryk (L: lav allel). Dette link findes i kaukasiere og asiater, men ikke i mennesker af afrikansk afstamning19.

Niveauet af udtryk for erythrocyt CR1 er også korreleret med tilstedeværelsen af punkt nukleotid mutationer i exon 13 kodning SCR 10 (I643T) og i exon 19 kodning SCR16 (Q981H). Det er højt i homozygot 643I/981Q og lav i homozygot 643T/981H individer20. Således “lav” individer udtrykke omkring 150 CR1/E, “medium” individer udtrykke omkring 500 CR1 / E, og “høj” individer udtrykke omkring 1.000 CR1 / E.

Ud over denne erythrocyt density polymorfi, CR1 er kendetegnet ved en længde polymorfi svarende til fire allotyper af forskellige størrelser: CR1 * 1 (190 kDa), CR1 * 2 (220 kDa), CR1 * 3 (160 kDa), og CR1 * 4 (250 kDa)21 og en antigen polymorfi svarende til blodgruppen KN22.

Vi præsenterer vores metode baseret på flow cytometri at bestemme tætheden af CR1/E. Ved hjælp af tre emner, hvis CR1/E tæthed er kendt, med et lavt densitetsniveau (180 CR1/E), et mellemhøjt niveau (646 CR1/E) og et højt densitetsniveau (966 CR1/E), er det let at måle den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) af deres erythrocytter eller røde blodlegemer (RBC) eller RBC MFI, efter anti-CR1 immunfarvning ved hjælp af en flowcytometer. Man kan derefter afbilde en standardlinje, der repræsenterer MFI som en funktion af CR1/E tæthed. Måling af MFI af emner, hvis CR1/E tæthed ikke er kendt, og sammenligne det med denne standard linje, er det muligt at bestemme den enkeltes CR1/E tæthed. Denne teknik har været brugt i mange år i laboratoriet, og har gjort det muligt for os at opdage en reduktion i udtrykket af erythrocyt CR1 i mange patologier såsom systemisk lupus erythematosus (SLE)23, Erhvervet immundefekt syndrom (AIDS)24, malaria25, og for nylig Alzheimers sygdom (AD)26,27. Udviklingen af lægemidler rettet mod CR1 til par med erythrocytter, som det er tilfældet med anti-trombotiske lægemidler28 kræver evaluering af CR1/E tæthed, og tilgængeligheden af en robust teknik til at kvantificere CR1.

Den præsenterede protokol kører i singlicate. Det er fleksibelt at bestemme tætheden af CR1/E på mange personer ved hjælp af specifikke kommercielt tilgængelige 96 brøndplader (se Materialetabel). Til dette formål er det nemt at tilpasse vores metode til enhver 96 brøndplade. For hver prøve fordeles en cellesuspension af erythrocytter (0,5 x 106-1 x 106 erythrocytter) pr. brønd. For hver brønd, først den primære anti-CR1 antistof tilsættes, derefter streptavidin PE, den sekundære anti-streptavidin antistof, og igen streptavidin PE, ved hjælp af de samme fortyndinger som dem af vores metode, men ved at tilpasse mængder og respekt for proportionalitet.

Blodprøver fra forsøgspersoner i området og fra forsøgspersoner, der skal kvantificeres for CR1, udtages samtidig, opbevares i køleskabet ved 4 °C og håndteres ved 4 °C (på is og/eller i køleskabet).

Protocol

Protokollen for indsamling og håndtering af blod hos mennesker blev gennemgået og godkendt af den regionale etiske komité (CPP Est II), og protokolnummeret er 2011-A00594-37. Da følgende protokol beskriver håndtering af humant blod, bør der følges institutionelle retningslinjer for bortskaffelse af biofarligt materiale. Laboratoriesikkerhedsudstyr, såsom laboratoriekitler og handsker, skal bæres. 1. Erythrocyt vask BEMÆRK: Dagen før håndtering fremstilles …

Representative Results

Erythrocytter af tre forsøgspersoner, hvis massefylde af CR1 er kendt (“lav” emne [180 CR1/E], “medium” emne [646 CR1/E], og “høj” emne [966 CR1/E]), og af to forsøgspersoner, hvis CR1 tæthed skulle bestemmes var immunstained af en anti-CR1 antistof koblet til et forstærkningssystem ved hjælp af phycoerythrin fluorokrom. I begyndelsen blev CR1-tætheden af forsøgspersonerne fra det lave område bestemt af Scatchard-metoden29 ved hjælp af radioaktivt mærkede antistoffer. De fastlagte stand…

Discussion

Der findes flere teknikker til at bestemme tætheden af erythrocyt CR1 (CR1/E). De første anvendte teknikker var agglutination af røde blodlegemer ved anti-CR1-antistoffer31 og dannelsen af rosetter ved tilstedeværelse af erythrocytter belagt med C3b32. Disse rudimentære teknikker blev hurtigt erstattet af immunfarvningsmetoder ved hjælp af radioaktivt betegnede anti-CR1-antistoffer1,33. Det er også muligt at …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker alle medlemmer af URCACyt, flow cytometri tekniske platform, personalet i Institut for Immunologi, og personalet i Institut for Intern Medicin og Geriatrics, der har bidraget til at optimere og validere protokollen. Dette arbejde blev finansieret af Reims Universitetshospitaler (tilskudsnummer AOL11UF9156).

Materials

1000E Barrier Tip Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 2079E sample pipetting
1-100 µL Bevelled, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1120-1840 sample pipetting
Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3) Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook immunostaining
Blouse protection
Bovin serum albumin (7,5%) Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 15260037 cytometry
Centrifuge Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 11176917 centrifugation
Clean Solution BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 340345 cytometry
Comorack-96 Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 944060P rack
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 655051 cytometry
Formaldehyde solution 36.5 % Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France F8775-25ML Fixation
10 µL Graduated, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1121-3810 sample pipetting
LSRFORTESSA Flow Cytometer BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 647788 cytometry
Microman Capillary Pistons Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 067494 sample pipetting
Micronic 1.40 mL round bottom tubes Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath MP32051 mix
Micropipette Microman – type M25 – Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 066379 sample pipetting
Phosphate buffered Saline (PBS) Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 10010031 cytometry
Pipette PS 325 mm, 10 mL Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 391952 sample pipetting
powder-free Nitrile Exam gloves Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA 486802 sample protection
Reference 2 pipette, 0,5-10 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000024 sample pipetting
Reference 2 pipette, 20-100 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000059 sample pipetting
Reference 2 pipette, 100-1000 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000083 sample pipetting
Rinse Solution BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 340346 cytometry
Round bottom tube Sarstedt, F-70150 Marnay, France 55.1579 cytometry
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 0030120086 mix
streptavidin R-PE Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France AS-60669 immunostaining
Tapered Centrifuge Tubes 50 mL Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 10203001 mix
Vector anti streptavidin biotin Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France BA-0500 immunostaining
Vortex-Genie 2 Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA SI-0236 mix
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
  2. Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T. Surface markers of complement receptor lymphocytes. Journal of Clinical Investigation. 62 (5), 1086-1092 (1978).
  3. Reynes, M., et al. Human follicular dendritic cells express CR1, CR2, and CR3 complement receptor antigens. The Journal of Immunology. 135 (4), 2687-2694 (1985).
  4. Gasque, P., et al. Identification and characterization of complement C3 receptors on human astrocytes. The Journal of Immunology. 156 (6), 2247-2255 (1996).
  5. Pascual, M., et al. Identification of membrane-bound CR1 (CD35) in human urine: evidence for its release by glomerular podocytes. Journal of Experimental Medicine. 179 (3), 889-899 (1994).
  6. Fearon, D. T. Regulation of the amplification C3 convertase of human complement by an inhibitory protein isolated from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5867-5871 (1979).
  7. Dobson, N. J., Lambris, J. D., Ross, G. D. Characteristics of isolated erythrocyte complement receptor type one (CR1, C4b-C3b receptor) and CR1-specific antibodies. The Journal of Immunology. 126 (2), 693-698 (1981).
  8. Schreiber, R. D., Pangburn, M. K., Muller-Eberhard, H. J. C3 modified at the thiolester site: acquisition of reactivity with cellular C3b receptors. Bioscience Reports. 1 (11), 873-880 (1981).
  9. Ross, G. D., et al. Generation of three different fragments of bound C3 with purified factor I or serum. II. Location of binding sites in the C3 fragments for factors B and H, complement receptors, and bovine conglutinin. Journal of Experimental Medicine. 158 (2), 334-352 (1983).
  10. Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
  11. Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. Journal of Experimental Medicine. 192 (12), 1797-1808 (2000).
  12. Cornacoff, J. B., et al. Primate erythrocyte-immune complex-clearing mechanism. Journal of Clinical Investigation. 71 (2), 236-247 (1983).
  13. Waxman, F. J., et al. Complement depletion accelerates the clearance of immune complexes from the circulation of primates. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1329-1340 (1984).
  14. Waxman, F. J., et al. Differential binding of immunoglobulin A and immunoglobulin G1 immune complexes to primate erythrocytes in vivo. Immunoglobulin A immune complexes bind less well to erythrocytes and are preferentially deposited in glomeruli. Journal of Clinical Investigation. 77 (1), 82-89 (1986).
  15. Horgan, C., Taylor, R. P. Studies on the kinetics of binding of complement-fixing dsDNA/anti-dsDNA immune complexes to the red blood cells of normal individuals and patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatology. 27 (3), 320-329 (1984).
  16. Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
  17. Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. Journal of Experimental Medicine. 164 (1), 50-59 (1986).
  18. Rodriguez de Cordoba, S., Rubinstein, P. Quantitative variations of the C3b/C4b receptor (CR1) in human erythrocytes are controlled by genes within the regulator of complement activation (RCA) gene cluster. Journal of Experimental Medicine. 164 (4), 1274-1283 (1986).
  19. Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in caucasian and african american populations. Clinical Immunology and Immunopathology. 87 (2), 176-183 (1998).
  20. Birmingham, D. J., et al. A CR1 polymorphism associated with constitutive erythrocyte CR1 levels affects binding to C4b but not C3b. Immunology. 108 (4), 531-538 (2003).
  21. Dykman, T. R., Hatch, J. A., Aqua, M. S., Atkinson, J. P. Polymorphism of the C3b/C4b receptor (CR1): characterization of a fourth allele. The Journal of Immunology. 134 (3), 1787-1789 (1985).
  22. Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sanguinis. 62 (4), 230-235 (1992).
  23. Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
  24. Jouvin, M. H., Rozenbaum, W., Russo, R., Kazatchkine, M. D. Decreased expression of the C3b/C4b complement receptor (CR1) in AIDS and AIDS-related syndromes correlates with clinical subpopulations of patients with HIV infection. AIDS. 1 (2), 89-94 (1987).
  25. Waitumbi, J. N., Donvito, B., Kisserli, A., Cohen, J. H., Stoute, J. A. Age-related changes in red blood cell complement regulatory proteins and susceptibility to severe malaria. The Journal of Infectious Diseases. 190 (6), 1183-1191 (2004).
  26. Mahmoudi, R., et al. Alzheimer’s disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiology of Aging. 36 (4), 5-12 (2015).
  27. Mahmoudi, R., et al. Inherited and Acquired Decrease in Complement Receptor 1 (CR1) Density on Red Blood Cells Associated with High Levels of Soluble CR1 in Alzheimer’s Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2175 (2018).
  28. Zaitsev, S., et al. Human complement receptor type 1-directed loading of tissue plasminogen activator on circulating erythrocytes for prophylactic fibrinolysis. Blood. 108 (6), 1895-1902 (2006).
  29. Scatchard, G. The attractions of proteins for small molecules and ions. Annals of the New York Academy of Sciences. 51 (4), 660-672 (1949).
  30. Cohen, J. H., et al. Enumeration of CR1 complement receptors on erythrocytes using a new method for detecting low density cell surface antigens by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 99 (1), 53-58 (1987).
  31. Minota, S., et al. Low C3b receptor reactivity on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus detected by immune adherence hemagglutination and radioimmunoassays with monoclonal antibody. Arthritis & Rheumatology. 27 (12), 1329-1335 (1984).
  32. Miyakawa, Y., et al. Defective immune-adherence (C3b) receptor on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. The Lancet. 2 (8245), 493-497 (1981).
  33. Lida, K., Mornaghi, R., Nussenzweig, V. Complement receptor (CR1) deficiency in erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. Journal of Experimental Medicine. 155 (5), 1427-1438 (1982).
  34. Tao, K., Nicholls, K., Rockman, S., Kincaid-Smith, P. Expression of complement 3 receptors (CR1 and CR3) on neutrophils and erythrocytes in patients with IgA nephropathy. Clinical Nephrology. 32 (5), 203-208 (1989).
  35. Nickells, M., et al. Mapping epitopes for 20 monoclonal antibodies to CR1. Clinical and Experimental Immunology. 112 (1), 27-33 (1998).
  36. Oi, V. T., Glazer, A. N., Stryer, L. Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 981-986 (1982).
  37. Chaiet, L., Wolf, F. J. The properties of streptavidin, a biotin-binding protein produced by streptomyces. Archives of Biochemistry and Biophysics. 20 (106), 1-5 (1964).
  38. Cockburn, I. A., Donvito, B., Cohen, J. H., Rowe, J. A. A simple method for accurate quantification of complement receptor 1 on erythrocytes preserved by fixing or freezing. Journal of Immunological Methods. 20 (271), 59-64 (2002).
  39. Chen, C. H., et al. Antibody CR1-2B11 recognizes a non-polymorphic epitope of human CR1 (CD35). Clinical & Experimental Immunology. 148 (3), 546-554 (2007).
  40. Ripoche, J., Sim, R. B. Loss of complement receptor type 1 (CR1) on ageing of erythrocytes. Studies of proteolytic release of the receptor. Biochemical Journal. 235 (3), 815-821 (1986).
  41. Moldenhauer, F., Botto, M., Walport, M. J. The rate of loss of CR1 from ageing erythrocytes in vivo in normal subjects and SLE patients: no correlation with structural or numerical polymorphisms. Clinical & Experimental Immunology. 72 (1), 74-78 (1988).
  42. Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
  43. Nickells, M. W., Subramanian, V. B., Clemenza, L., Atkinson, J. P. Identification of complement receptor type 1-related proteins on primate erythrocytes. The Journal of Immunology. 154 (6), 2829-2837 (1995).
  44. Hebert, L. A., Birmingham, D. J., Shen, X. P., Cosio, F. G. Stimulating erythropoiesis increases complement receptor expression on primate erythrocytes. Clinical Immunology and Immunopathology. 62 (3), 301-306 (1992).
  45. Davis, K. A., Abrams, B., Iyer, S. B., Hoffman, R. A., Bishop, J. E. Determination of CD4 antigen density on cells: Role of antibody valency, avidity, clones, and conjugation. Cytometry. 33 (2), 197-205 (1998).
  46. Pannu, K. K., Joe, E. T., Iyer, S. B. Performance evaluation of QuantiBRITE phycoerythrin beads. Cytometry. 45 (4), 250-258 (2001).
  47. Barnett, D., Storie, I., Wilson, G. A., Granger, V., Reilly, J. T. Determination of leucocyte antibody binding capacity (ABC): the need for standardization. Clinical Laboratory Haematology. 20 (3), 155-164 (1998).
  48. Bikoue, A., et al. Quantitative analysis of leukocyte membrane antigen expression: normal adult values. Cytometry. 26 (2), 137-147 (1996).
  49. Serke, S., van Lessen, A., Huhn, D. Quantitative fluorescence flow cytometry: a comparison of the three techniques for direct and indirect immunofluorescence. Cytometry. 33 (2), 179-187 (1998).

Tags

ErythrocyteComplement Receptor 1Flow CytometryCell Receptor DensityImmunostainingBiotinylated AntibodyStreptavidin Phycoerythrin

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Kisserli, A., Audonnet, S., Duret, V., Tabary, T., Cohen, J. H. M., Mahmoudi, R. Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (159), e60810, doi:10.3791/60810 (2020).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image