Mesurer le récepteur de complément d’érythrocyte 1 à l’aide de la cytométrie des débits
Summary
Le but de cette méthode est de déterminer la densité CR1 dans les érythrocytes de n’importe quel sujet en comparant avec trois sujets dont la densité érythrocyte CR1 est connue. La méthode utilise la cytométrie de flux après immunostaining des érythrocytes des sujets par un anticorps monoclonal anti-CR1 couplé à un système amplifié utilisant la phycoerythrine (PE).
Abstract
CR1 (CD35, Récepteur de complément de type 1 pour C3b/C4b) est une glycoprotéine à forte membrane de poids moléculaire d’environ 200 kDa qui contrôle l’activation de complément, transporte des complexes immunitaires, et participe à des réponses immunitaires humoristiques et cellulaires. CR1 est présent à la surface de nombreux types de cellules, y compris les érythrocytes, et présente des polymorphismes de longueur, de structure (Knops, ou KN, groupe sanguin) et de densité. La densité moyenne de CR1 par érythrocyte (CR1/E) est de 500 molécules par érythrocyte. Cette densité varie d’un individu à l’autre (100 à 1 200 CR1/E) et d’un érythrocyte à un autre chez le même individu. Nous présentons ici une méthode robuste de cytométrie de flux pour mesurer la densité de CR1/E, y compris dans les sujets exprimant une basse densité, avec l’aide d’un système d’immunostaining amplificateur. Cette méthode nous a permis de montrer l’abaissement de l’expression érythrocyte CR1 dans des maladies telles que la maladie d’Alzheimer (SA), le lupus erythematosus systémique (LE), le sida ou le paludisme.
Introduction
CR1 (récepteur de complément de type 1, CD35) est un 200 kDa transmembrane glycoprotéine présente à la surface de nombreux types de cellules, tels que les érythrocytes1, B lymphocytes2, cellules monocytiques, certaines cellules T, cellules dendritiques folliculaires3, astrocytes foetaux4, et podocy glomerular5tes. CR1 interférant avec ses ligands C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, un sous-unité de la première composante de complément, C1q10 et MBL (lectine mannan-contraignant)11 inhibe l’activation du complément et est impliqué dans la réponse immunitaire humoristique et cellulaire.
Chez les primates, y compris les humains, l’érythrocyte CR1 est impliqué dans le transport de complexes immunitaires vers le foie et la rate, pour purifier le sang et prévenir leur accumulation dans les tissus vulnérables tels que la peau ou les reins12,13,14. Ce phénomène d’adhérence immunitaire entre les complexes immunitaires et les érythrocytes dépend du nombre de molécules CR115. Chez l’homme, la densité moyenne de CR1/E n’est que de 500 (c.-à-d. 500 molécules de CR1 par érythrocyte). Cette densité varie d’un individu à l’autre (100 à 1 200 CR1/E) et d’un érythrocyte à un autre chez le même individu. Certaines personnes de phénotype “null” expriment moins de 20 CR1/E16.
La densité de CR1/E est réglementée par deux allèles autosomiques co-dominants liés à une mutation ponctuelle dans l’intron 27 du codage génétique pour CR1-117,18. Cette mutation produit un site de restriction supplémentaire pour l’enzyme HindIII. Les fragments de restriction obtenus après digestion avec HindIII dans ce cas sont 7,4 kb pour l’allèle lié à une expression forte de CR1 (H: allèle élevé) et 6,9 kb pour l’allèle lié à une faible expression CR1 (L: faible allèle). Ce lien se trouve chez les Caucasiens et les Asiatiques, mais pas chez les personnes d’ascendance africaine19.
Le niveau d’expression de l’érythrocyte CR1 est également corrélé avec la présence de mutations nucléotides ponctuelles dans l’exon 13 codant SCR 10 (I643T) et dans l’encodage exon 19 SCR16 (Q981H). Il est élevé en homozygous 643I/981Q et faible en homozygous 643T/981H individus20. Ainsi, les personnes « faibles » expriment environ 150 CR1/E, les individus « moyens » expriment environ 500 CR1/E, et les individus « élevés » expriment environ 1 000 CR1/E.
En plus de ce polymorphisme de densité érythrocyte, CR1 se caractérise par un polymorphisme de longueur correspondant à quatre allotypes de tailles différentes : CR1-1 (190 kDa), CR1-2 (220 kDa), CR1-3 (160 kDa), et CR1-4 (250 kDa)21 et un polymorphisme antigénique correspondant au groupe sanguin KN22.
Nous présentons notre méthode basée sur la cytométrie d’écoulement pour déterminer la densité de CR1/E. À l’aide de trois sujets dont la densité CR1/E est connue, exprimant un faible niveau de densité (180 CR1/E), un niveau de densité moyenne (646 CR1/E) et un niveau de densité élevée (966 CR1/E), il est facile de mesurer l’intensité moyenne de fluorescence (IMF) de leurs érythrocytes ou globules rouges (RBC), ou RBC MFI, après l’immunodétoïx anti-CR1 à l’aide d’un cytomètre. On peut ensuite tracer une ligne standard représentant l’IMF en fonction de la densité CR1/E. En mesurant l’IMF des sujets dont la densité CR1/E n’est pas connue et en la comparant à cette ligne standard, il est possible de déterminer la densité CR1/E des individus. Cette technique a été utilisée pendant de nombreuses années en laboratoire, et nous a permis de détecter une réduction de l’expression de l’érythrocyte CR1 dans de nombreuses pathologies telles que le lupus erythématosus systémique (LLE)23, syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA)24, paludisme25, et récemment la maladie d’Alzheimer (AD)26,27. Le développement de médicaments ciblant CR1 pour coupler avec des érythrocytes, comme dans le cas des médicaments anti-thrombotiques28 nécessite l’évaluation de la densité CR1/E, et la disponibilité d’une technique robuste pour quantifier CR1.
Le protocole présenté fonctionne en singlicate. Il est adaptable de déterminer la densité de CR1/E sur de nombreuses personnes utilisant des plaques de puits 96 disponibles dans le commerce (voir tableau des matériaux). À cette fin, il est facile d’adapter notre méthode à n’importe quelle plaque de puits 96. Pour chaque échantillon, une suspension cellulaire des érythrocytes (0,5 x 106x 1 x 106 érythrocytes) est distribuée par puits. Pour chaque puits, d’abord l’anticorps anti-CR1 primaire est ajouté, puis streptavidin PE, l’anticorps anti-streptavidine secondaire, et encore une fois streptavidin PE, en utilisant les mêmes dilutions que celles de notre méthode, mais en adaptant les volumes et en respectant la proportionnalité.
Les échantillons de sang provenant de sujets de la gamme et des sujets à quantifier pour LE CR1 doivent être prélevés en même temps, stockés au réfrigérateur à 4 oC et manipulés à 4 oC (sur glace et/ou au réfrigérateur).
Protocol
Representative Results
Discussion
Plusieurs techniques sont disponibles pour déterminer la densité de l’érythrocyte CR1 (CR1/E). Les premières techniques utilisées étaient l’agglutination des globules rouges par les anticorps anti-CR131 et la formation de rosettes en présence d’érythrocytes enduits de C3b32. Ces techniques rudimentaires ont été rapidement remplacées par des méthodes d’immunostaining à l’aide d’anticorps anti-CR1 radiolactés1,<sup …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions tous les membres de l’URCACyt, la plate-forme technique de cytométrie des flux, le personnel du Département d’immunologie, et le personnel du Département de médecine interne et de gériatrie, qui ont contribué à l’optimisation et à la validation du protocole. Ces travaux ont été financés par les Hôpitaux Universitaires de Reims (numéro de subvention AOL11UF9156).
Materials
| 1000E Barrier Tip | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 2079E | sample pipetting |
| 1-100 µL Bevelled, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1120-1840 | sample pipetting |
| Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3) | Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook | immunostaining | |
| Blouse | protection | ||
| Bovin serum albumin (7,5%) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 15260037 | cytometry |
| Centrifuge | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 11176917 | centrifugation |
| Clean Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340345 | cytometry |
| Comorack-96 | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 944060P | rack |
| Cytometer Setup & Tracking Beads Kit | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 655051 | cytometry |
| Formaldehyde solution 36.5 % | Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France | F8775-25ML | Fixation |
| 10 µL Graduated, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1121-3810 | sample pipetting |
| LSRFORTESSA Flow Cytometer | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 647788 | cytometry |
| Microman Capillary Pistons | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 067494 | sample pipetting |
| Micronic 1.40 mL round bottom tubes | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | MP32051 | mix |
| Micropipette Microman – type M25 – | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 066379 | sample pipetting |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10010031 | cytometry |
| Pipette PS 325 mm, 10 mL | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 391952 | sample pipetting |
| powder-free Nitrile Exam gloves | Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA | 486802 | sample protection |
| Reference 2 pipette, 0,5-10 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000024 | sample pipetting |
| Reference 2 pipette, 20-100 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000059 | sample pipetting |
| Reference 2 pipette, 100-1000 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000083 | sample pipetting |
| Rinse Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340346 | cytometry |
| Round bottom tube | Sarstedt, F-70150 Marnay, France | 55.1579 | cytometry |
| Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 0030120086 | mix |
| streptavidin R-PE | Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France | AS-60669 | immunostaining |
| Tapered Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10203001 | mix |
| Vector anti streptavidin biotin | Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France | BA-0500 | immunostaining |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA | SI-0236 | mix |
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