ワクチン用非天然アミノ酸組み合わせとクリック化学を組み合わせた均質なグリココンジュゲート
Summary
遺伝的コード拡張は、定義された部位のキャリアタンパク質に対角関数群を持つ非天然アミノ酸の導入に適用される。この二元性機能は、均質なグリココンジュゲートワクチンを提供するために、炭水化物抗原の部位選択的結合に対してさらに使用される。
Abstract
遺伝子コードの拡張は、非天然アミノ酸(UAA)をタンパク質に導入してその特性を改変したり、新しいタンパク質機能を研究または作成したり、タンパク質コンジュゲートにアクセスしたりするための強力なツールです。停止コドン抑制、特にアンバーコドン抑制は、定義された位置でUAAを遺伝的に導入する最も一般的な方法として出現した。この方法論は、本明細書において、生体直交性官能基を収容するUAAを含む担体タンパク質の調製に適用される。この反応性ハンドルは、次に、合成オリゴ糖ハプテンを特異的かつ効率的に移植し、均質なグリココンジュゲートワクチンを提供するために使用することができる。このプロトコルは、1:1炭水化物ハプテン/キャリアタンパク質比におけるグリココンジュゲートの合成に限定されるが、多数の二元性官能基のペアに適している。グリココンジュゲートワクチンの均質性は、完全な物理化学的特徴付けを確実にする重要な基準であり、それにより、より厳しい薬物規制機関の勧告を満たし、古典的な共役戦略によって満たされていない基準である。さらに、このプロトコルは、実際のコンジュゲートワクチンの構造を細かく調整することを可能にし、構造と免疫原性の関係に対処するためのツールを生み出す。
Introduction
グリココンジュゲートワクチンは、感染症の予防治療に利用できるワクチンの必要不可欠な要素です。彼らは、若い幼児を含む広範な年齢層で安全で、十分に許容され、効率的です。それらは、髄膜炎球菌、肺炎球菌またはインフルエンザ菌b型のようなカプチオ細菌によって引き起こされる感染症に対する最適な防御を提供する。グリココンジュゲートワクチンは、これらの表面発現多糖を模倣する細菌または合成オリゴ糖のカプセルを形成する精製された細菌多糖類から作られており、これはキャリアタンパク質に共有結合しています。キャリアタンパク質の存在は、炭水化物抗原3によって発現される抗原決定基に対する保護的な体液性免疫応答を促進するために不可欠である。糖質抗原の慎重な選択および産生とは別に、糖コンジュゲートワクチンの有効性に影響を及ぼすのが知られている特徴は、キャリアタンパク質の性質、結合化学(使用する場合はリンカーの性質および長さを含む)、または糖類/タンパク質比3である。明らかに、糖類がタンパク質に結合する位置と接続ポイントの数は免疫原性に関連しています。現在までに、これらの2つのパラメータは、グリココンジュゲートの調製が主に経験的なままであるため、ほとんど研究されていません。これらの合成は、通常、それぞれ、リジンまたはアスパラギン酸/グルタミン酸の機能の使用に依存する、キャリアタンパク質配列上に存在する。これは単一ではなく、グリココンジュゲートの異種混合物につながります。
タンパク質中のアミノ酸残基の反応性、入手可能性または分布に関する遊びは、糖類/タンパク質結合性の効果を文書化するためにより信頼性の高い、より定義された糖コンジュゲートを生じさせる4。この目標に向けた一歩は、細胞工場5,6における制御されたグリコジュゲートワクチンの製造を可能にする組換えプロセスであるタンパク質グリカンカップリング技術を適用することによって達成することができる。しかし、グリコシル化は、D/EXNYS/Tセクオン内のアスパラギン残基(Xは20種類の天然アミノ酸のうち任意である)でのみ行われ、キャリアタンパク質には自然に存在しません。
選択的突然変異誘発、特にシステインを組み込んで高度かつ選択的な反応性を利用する部位は、代替7,8として出現する。UAAを配列に組み込んだキャリアタンパク質の製造は、均質なグリココンジュゲートワクチン調製に対してさらに柔軟性を提供することができます。100以上のUAAが開発され、さらに様々なタンパク質9、10に組み込まれています。それらの多くは、翻訳後修飾11を行うために通常使用される生体直交機能を含むか、生物物理学的プローブ12または薬物13を移植するが、炭水化物抗原とのさらなる結合のための理想的なハンドルである。成功例は、無細胞タンパク質合成15を用いてBiotech14によって主張されているが、この戦略に従うグリココンジュゲートワクチンの調製は依然として普及するのを待っている。
変異キャリアタンパク質の産生のためのin vivo戦略の適用には、特定のコドン、コドンを認識するtRNA、およびtRNA上のUAAの伝達を特異的に触媒するアミノアシルtRNA合成酵素(aaRS)を含む改変翻訳機械が必要である(図1)16。ピロリシンアンバーストップコドン抑制は、UAA、特にプロピルジルリジン(PrK)17を組み込むために最も広く使用される方法の一つである。後者は、アジド機能化炭水化物ハプテンと反応して、完全に定義された均質なグリココンジュゲートを提供することができます。本稿では、アルキンハンドルを持つUAAであるプロパルギルL-リジンを合成する方法、細菌中での翻訳中に標的タンパク質に組み込む方法、そして最後に、修飾タンパク質と、クリックケミストリーを用いたアジド関数を担うハプテンとの結合を行う方法について述べています。
Protocol
Representative Results
Discussion
部位特異的変異誘発は、グリココンジュゲートワクチン7、8、14を調製することを目的としてほとんど使用されていないタンパク質の定義された位置に特定のアミノ酸を組み込むための簡単な戦略である。20の天然アミノ酸アプローチに基づく古典的な変異生成は翻訳機械の変更が要求されないので非常に効率的である。シ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.Cは、ラ・レジオン・ペイ・ド・ラ・ロワール(パリ・サイエンティフィック・プログラム「BioSynProt」)、特にT.V.への博士課程のフェローシップからの財政的支援を感謝して認めています。我々はまた、ロバート・B・クアト(INRA UMR0792、CNRS UMR5504、LISBP、トゥールーズ、フランス)の貴重な技術的アドバイスを認めます。
Materials
| AIM (autoinductif medium) | Formedium | AIMLB0210 | Solid powder |
| Boc-Lys-OH | Alfa-Aesar | H63859 | Solid powder |
| BL21(DE3) | Merck Novagen | 69450 | E. coli str. B, F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB–mB–) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS) |
| Dialysis membrane | |||
| DNAseI | |||
| Filter 0.45 µm | |||
| L-arabinose | |||
| lysozyme | |||
| Ni-NTA resin | Machery Nagel | Protino | Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol |
| Pall centrifugal device | |||
| pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH | this study | same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene | |
| pET24d-mPsaA-WT | this study | pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene | |
| pEVOL plasmid | gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19) | plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene | |
| Propargyl chloroformate | Sigma-Aldrich | 460923 | Liquid |
| Sonicator | Thermo Fisher | FB120-220 |
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