Genetische code uitbreiding wordt toegepast voor de introductie van een onnatuurlijk aminozuur met een biorthogonale functionele groep op een drager eiwit op een gedefinieerde site. De biorthogonale functie wordt verder gebruikt voor de plaatsselectieve koppeling van een koolhydraatantgeen om een homogeen glycoconjugaatvaccin te bieden.
Genetische code uitbreiding is een krachtig instrument om onnatuurlijke aminozuren (IA’s) in eiwitten te introduceren om hun kenmerken te wijzigen, om nieuwe eiwitfuncties te bestuderen of te creëren of om toegang te hebben tot eiwitconjugaten. Stop codon onderdrukking, in het bijzonder amber codon onderdrukking, is naar voren gekomen als de meest populaire methode om genetisch te introduceren UAAs op gedefinieerde posities. Deze methode wordt hierin toegepast op de bereiding van een dragereiwit dat een UAA bevat die een bioorthogonale functionele groep herbergt. Deze reactieve handgreep kan vervolgens worden gebruikt om specifiek en efficiënt een synthetische oligosaccharide hapten te transplanteren om een homogeen glycoconjugaatvaccin te leveren. Het protocol is beperkt tot de synthese van glycoconjugates in een 1:1 koolhydraat hapten /drager eiwit verhouding, maar vatbaar voor tal van paren van biorthogonal functionele groepen. Glycococonjugate vaccin homogeniteit is een belangrijk criterium om volledige fysisch-chemische karakterisering te waarborgen, waardoor, voldoen aan meer en meer veeleisende drug regelgevende instantie aanbevelingen, een criterium dat wordt onvervuld door klassieke vervoeging strategieën. Bovendien maakt dit protocol het mogelijk om de structuur van het eigenlijke conjugaatvaccin nauwkeurig af te stemmen, wat aanleiding geeft tot instrumenten om structuur-immunogeniciteitsrelaties aan te pakken.
Glycoconjugate vaccins zijn essentiële elementen van het vaccin arsenaal beschikbaar voor de profylactische behandeling van infectieziekten. Ze zijn veilig, goed verdragen en efficiënt in een brede leeftijdsgroep met inbegrip van jonge zuigelingen. Ze bieden de optimale afweer tegen infecties veroorzaakt door gekapseizeerde bacteriën zoals meningokokken, pneumokokken of Haemophilus influenzae type b1. Glycococonjugate vaccins zijn gemaakt van gezuiverde bacteriële polysaccharides die de capsules van bacteriën of synthetische oligosadariden die deze oppervlakte-uitgedrukte polysaccharidesnabootsen 2, die covalent zijn gekoppeld aan een drager eiwit. De aanwezigheid van een dragereiwit is essentieel om beschermende humorale immuunreacties te bevorderen gericht tegen de antigene determinant uitgedrukt door de koolhydraatantigenen3. Afgezien van een zorgvuldige selectie en productie van het koolhydraatantgeen, zijn de kenmerken waarvan bekend is dat ze een invloed uitoefenen op de werkzaamheid van een glycoconjugaatvaccin: de aard van het dragereiwit, de vervoegingschemie (inclusief de aard en de lengte van de linker indien gebruikt), of de saccharide/eiwitverhouding3. Uiteraard zijn de posities waarin de saccharide is vervoegd aan het eiwit en het aantal verbindingspunten relevant voor immunogeniciteit. Tot op heden zijn deze twee parameters nauwelijks bestudeerd omdat de voorbereiding van de glycoconjugates grotendeels empirisch blijft. Hun synthese is meestal gebaseerd op het gebruik van amine- of carboxylzuurfuncties van respectievelijk lysine of aspartic/glutaminezuurzijketenresten die op de dragereiwitsequentie aanwezig zijn. Dit leidt niet tot een enkele, maar tot een heterogeen mengsel van glycoconjugates.
Spelen op de reactiviteit, toegankelijkheid of distributie van de aminozuurresten in het eiwit geeft aanleiding tot meer gedefinieerde glycoconjucten die betrouwbaarder zijn om het effect van saccharide/eiwitconnectiviteit te documenteren4. Een stap voorwaarts in de richting van dit doel kan worden bereikt door het toepassen van eiwitglycan koppelingstechnologie, een recombinant proces dat de productie van gecontroleerde glycoconjugaatvaccins in celfabrieken5,6mogelijk maakt . De glycosylation vindt echter uitsluitend plaats bij een aspergesidu in D/EXNYS/T-sequons (waarbij X een van de 20 natuurlijke aminozuren is), die niet van nature aanwezig zijn op de dragereiwitten.
Plaats selectieve mutagenese en in het bijzonder de integratie van cysteines om hun zeer en selectieve reactiviteit te benutten lijkt een alternatief7,8. Productie van drager-eiwitten waarin UAA’s in hun volgorde zijn verwerkt, kunnen nog meer flexibiliteit bieden voor homogene glycoconjugaatvaccinpreparaatatie. Meer dan 100 NAA’s zijn ontwikkeld en verder opgenomen in verschillende eiwitten9,10. Velen van hen bevatten bioorthogonale functies meestal gebruikt voor het uitvoeren van post translationele wijzigingen11 of om biofysische sondes12 of drugs13 enten, maar die ideale handvatten voor verdere vervoeging met koolhydraat antigenen. Succesvolle voorbeelden zijn geclaimd door Biotech14 met behulp van cel-vrije eiwitsynthese15, maar de voorbereiding van glycoconjugaat vaccins volgens deze strategie wacht nog steeds op steeds gepopulariseerd.
De toepassing van de in vivo strategie voor de productie van gemuteerde dragereiwit vergt een gewijzigde translationele machinerie die een specifieke codon, een tRNA dat de codon erkent en een aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) die specifiek de overdracht van de UAA op tRNA(Figuur 1)16) katalyseert . De pyrrolysine amber stop codon onderdrukking is een van de meest gebruikte methoden om UAA op te nemen, met name de propargyl-lysine (PrK)17. Deze laatste kan op zijn beurt reageren met azido-gefunctionaliseerde koolhydraathaten om volledig gedefinieerde, homogene glycoconjugates te bieden. In het onderhavige manuscript beschrijven we hoe we het propargyl-L-lysine, een UAA met een alkynegreep, kunnen synthetiseren, hoe het tijdens de vertaling in een bacterie in een doeleiwit worden opgenomen en hoe je vervoeging uitvoeren tussen het gemodificeerde eiwit en een hapten die een azide-functie dragen met behulp van klikchemie.
Site-directed mutagenesis is een eenvoudige strategie om specifieke aminozuren op te nemen in een gedefinieerde positie van een eiwit dat nauwelijks wordt gebruikt met het doel om glycoconjugate vaccins7,8,14voor te bereiden . Klassieke mutagenesis op basis van de 20 natuurlijke aminozuren aanpak is zeer efficiënt, omdat er geen wijziging van de vertaalmachines nodig is. Cysteïne mutaties zijn meestal gericht op verdere verken…
The authors have nothing to disclose.
E.C. erkent dankbaar de financiële steun van La Région Pays de la Loire (Pari Scientifique Program “BioSynProt”), in het bijzonder een doctoraatsbeurs voor T.V. We erkennen ook Dr. Robert B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Toulouse, Frankrijk) voor zijn kostbare technische adviezen.
AIM (autoinductif medium) | Formedium | AIMLB0210 | Solid powder |
Boc-Lys-OH | Alfa-Aesar | H63859 | Solid powder |
BL21(DE3) | Merck Novagen | 69450 | E. coli str. B, F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB–mB–) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS) |
Dialysis membrane | |||
DNAseI | |||
Filter 0.45 µm | |||
L-arabinose | |||
lysozyme | |||
Ni-NTA resin | Machery Nagel | Protino | Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol |
Pall centrifugal device | |||
pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH | this study | same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene | |
pET24d-mPsaA-WT | this study | pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene | |
pEVOL plasmid | gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19) | plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene | |
Propargyl chloroformate | Sigma-Aldrich | 460923 | Liquid |
Sonicator | Thermo Fisher | FB120-220 |