Однородный гликоконъюгированный, производимый комбинированной неестественной аминокислотной инкорпорацию и нажмите-химию для целей вакцины
Summary
Генетическое расширение кода применяется для введения неестественной аминокислоты, несущей биоргононо-функциональную группу на несущем белке в определенном месте. Биортогональная функция далее используется для селективного соединения углеводного антигена для обеспечения однородной гликоконъюгации вакцины.
Abstract
Расширение генетического кода является мощным инструментом для внедрения неестественных аминокислот (УА) в белки для изменения их характеристик, изучения или создания новых белковых функций или доступа к протеиновым конъюгратам. Остановить подавление кодона, в частности подавления янтарного кодона, стало самым популярным методом генетического внедрения БПЛА на определенных позициях. Эта методология применяется к подготовке несущего белка, содержащего UAA укрывательство биоортогональной функциональной группы. Эта реактивная ручка может быть использована для конкретного и эффективного прививки синтетического олигосахарида hapten для обеспечения однородной гликоконъюгации вакцины. Протокол ограничен синтезом гликоконъюгатов в соотношении белка 1:1 углеводов, но податлив к многочисленным парам биортогональных функциональных групп. Гликококонджгейт однородность вакцины является важным критерием для обеспечения полной физико-химической характеристики, тем самым удовлетворяя все более и более требовательные рекомендации агентства по регулированию лекарственных препаратов, критерий, который не удовлетворяется классическими стратегиями спряжения. Кроме того, этот протокол позволяет точно настроить структуру фактической конъюгации вакцины, что дает возможность использовать инструменты для решения отношений между структурой и иммуногенностью.
Introduction
Гликоконъюгированные вакцины являются важными элементами арсенала вакцин, доступного для профилактического лечения инфекционных заболеваний. Они безопасны, хорошо переносятся и эффективны в широкой возрастной группе, включая маленьких детей. Они обеспечивают оптимальную защиту от инфекций, вызванных капсулированных бактерий, таких как менингококк, пневмококк или гемофильные грипп типа b1. Гликоконъюгированные вакцины сделаны из очищенных бактериальных полисахаридов, которые образуют капсулы бактерий или синтетических олигосахаридов, которые имитируют эти поверхностно выраженныеполисахариды 2, которые ковалентно связаны с белками перевозчика. Наличие белка перевозчика имеет важное значение для содействия защитной гуморальной иммунной реакции, направленной против антигенного детерминанта, выраженного углеводныхантигенов 3. Помимо тщательного отбора и производства углеводного антигена, функции, как известно, оказывают влияние на эффективность вакцины гликоконъюгации являются: природа белка перевозчика, спряжение химии (в том числе характер и длина связующим звеном при использовании), или сахарид / соотношениебелка 3. Очевидно, что позиции, при которых сахарид спрягаются с белком, а также количество точек подключения имеют отношение к иммуногенности. На сегодняшний день эти два параметра практически не изучены, поскольку подготовка гликоконъюгатов остается в основном эмпирической. Их синтез обычно опирается на использование амина или карбоксилиновой кислоты функции, соответственно, лизина или аспарагиновой / глутамической кислоты боковой цепи остатков, присутствующих на последовательности белка перевозчика. Это приводит не к одному, а к неоднородной смеси гликоконъюгатов.
Игра на реактивности, доступности или распределении аминокислотных остатков в белке приводит к более определенным гликоконъюгатам, которые являются более надежными для документирования эффекта сахарид/белковой связи4. Шаг вперед к этой цели может быть достигнут путем применения технологии соединения белка гликан, рекомбинантный процесс, который позволяет производство контролируемых гликоконъюгированных вакцин на клеточныхфабриках 5,6. Тем не менее, гликозиляция происходит исключительно на аспарагин остаток в D / EXNYS / T sequons (в котором X любой из 20 природных аминокислот), естественно, не присутствует на несущей белков.
Сайт селективного мутагенеза и, в частности, включение цистеин для использования их высокой и селективной реактивности появляетсяв качестве альтернативы 7,8. Производство белков-носителей, включающих БПЛА в их последовательность, может предложить еще большую гибкость для однородного гликоконъюгирования вакцины. Более 100 БПЛА были разработаны и дополнительно включены в различные белки9,10. Многие из них содержат биоортогональные функции, обычно используемые для выполнения постреакционныхмодификаций 11 или для прививкибиофизических зондов 12 или препаратов 13, но которые являются идеальными ручками для дальнейшего спряжения с углеводными антигенами. Успешные примеры были заявлены Biotech14 с использованием клеточного синтезабелка 15, но подготовка гликоконъюгированных вакцин в соответствии с этой стратегией все еще ждет становится популяризировал.
Применение стратегии in vivo для производства мутировавшего белка перевозчика нуждается в модифицированном переводном механизме, который включает в себя конкретный кодон, тРНК, распознающий кодон, и синтетазы аминоакил-тРНК (aaRS), который специально катализирует передачу UAA на тРНК (Рисунок 1)16. Пирролизин янтаря остановить подавление кодона является одним из наиболее широко используемых методов для включения UAA, в частности, пропаргил-лизин (PrK)17. Последние, в свою очередь, могут реагировать с азидо-функциональными углеводными haptens обеспечить полностью определенные, однородные гликоконъюгаты. В настоящей рукописи мы описываем, как синтезировать пропаргиль-L-лизин, UAA проведения алкин ручкой, как включить его в целевой белок во время его перевода в бактерии и, наконец, как выполнить спряжение между модифицированным белком и hapten проведения функции азида с помощью щелчка химии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сайт-направленный мутагенез является простой стратегией для включения конкретных аминокислот в определенном положении белка, который остается едва используется с целью подготовкигликоконъюгированных вакцин 7,8,14. Классический мутаг…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.C. с благодарностью признает финансовую поддержку от Ла-Регион платит де ла Луар (Пари Scientifique программы “BioSynProt”), в частности, докторскую стипендию Т.В. Мы также признательны д-ру Роберту Б. Квасту (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Тулуза, Франция) за его ценные технические советы.
Materials
| AIM (autoinductif medium) | Formedium | AIMLB0210 | Solid powder |
| Boc-Lys-OH | Alfa-Aesar | H63859 | Solid powder |
| BL21(DE3) | Merck Novagen | 69450 | E. coli str. B, F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB–mB–) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS) |
| Dialysis membrane | |||
| DNAseI | |||
| Filter 0.45 µm | |||
| L-arabinose | |||
| lysozyme | |||
| Ni-NTA resin | Machery Nagel | Protino | Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol |
| Pall centrifugal device | |||
| pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH | this study | same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene | |
| pET24d-mPsaA-WT | this study | pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene | |
| pEVOL plasmid | gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19) | plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene | |
| Propargyl chloroformate | Sigma-Aldrich | 460923 | Liquid |
| Sonicator | Thermo Fisher | FB120-220 |
Riferimenti
- Rappuoli, R. Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms. Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).
- Verez-Bencomo, V., et al. A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b. Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).
- Berti, F., Adamo, R. Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification. Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).
- Stefanetti, G., et al. Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).
- Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. W. Recent advances in the production of recombinant glycoconjugate vaccines. NPJ Vaccines. 4, 16 (2019).
- Ma, Z., Zhang, H., Wang, P. G., Liu, X. W., Chen, M. Peptide adjacent to glycosylation sites impacts immunogenicity of glycoconjugate vaccine. Oncotarget. 9 (1), 75-82 (2018).
- Grayson, E. J., Bernardes, G. J. L., Chalker, J. M., Boutureira, O., Koeppe, J. R., Davis, B. G. A coordinated synthesis and conjugation strategy for the preparation of homogeneous glycoconjugate vaccine candidates. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 50 (18), 4127-4132 (2011).
- Pillot, A., et al. Site-Specific Conjugation for Fully Controlled Glycoconjugate Vaccine Preparation. Frontiers in Chemistry. , (2019).
- Neumann-Staubitz, P., Neumann, H. The use of unnatural amino acids to study and engineer protein function. Current Opinion in Structural Biology. 38, 119-128 (2016).
- Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. Designing logical codon reassignment – Expanding the chemistry in biology. Chemical Science. 6 (1), 50-69 (2015).
- Chen, H., Venkat, S., McGuire, P., Gan, Q., Fan, C. Recent Development of Genetic Code Expansion for Posttranslational Modification Studies. Molecules (Basel, Switzerland). 23 (7), (2018).
- Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Molecular Imaging–Part 2: Peptide Tags and Unnatural Amino Acids. Molecular imaging and biology: MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (2), 153-165 (2016).
- Kularatne, S. A., et al. A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 53 (44), 11863-11867 (2014).
- . Patent US20180333484 Polypeptide-Antigen Conjugates with Non-Natural Amino Acids Available from: https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&recNum=65&docAn=15859251&queryString=(GBS) (2018)
- Quast, R. B., Mrusek, D., Hoffmeister, C., Sonnabend, A., Kubick, S. Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis. FEBS letters. 589 (15), 1703-1712 (2015).
- Wang, L. Engineering the Genetic Code in Cells and Animals: Biological Considerations and Impacts. Accounts of Chemical Research. 50 (11), 2767-2775 (2017).
- Brabham, R., Fascione, M. A. Pyrrolysine Amber Stop-Codon Suppression: Development and Applications. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 18 (20), 1973-1983 (2017).
- . Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction (2019)
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
- Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
- Prasanna, M., et al. Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine. European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 129, 31-41 (2019).
- Morrison, K. E., et al. Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis. Journal of Clinical Microbiology. 38 (1), 434-437 (2000).
- Lin, H., Lin, Z., Meng, C., Huang, J., Guo, Y. Preparation and immunogenicity of capsular polysaccharide-surface adhesin A (PsaA) conjugate of Streptococcuspneumoniae. Immunobiology. 215 (7), 545-550 (2010).
- Safari, D., et al. Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against Streptococcus pneumoniae type 14. Infection and Immunity. 76 (10), 4615-4623 (2008).
- Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chemistry & Biology. 16 (3), 323-336 (2009).
- Lawrence, M. C., Pilling, P. A., Epa, V. C., Berry, A. M., Ogunniyi, A. D., Paton, J. C. The crystal structure of pneumococcal surface antigen PsaA reveals a metal-binding site and a novel structure for a putative ABC-type binding protein. Structure (London, England: 1993). 6 (12), 1553-1561 (1998).
- Wright, T. H., Davis, B. G. Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins. Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).
- Dadová, J., Galan, S. R., Davis, B. G. Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine. Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).
- Worst, E. G., et al. Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System. Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).
- Carboni, F., et al. GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation. The Journal of Infectious Diseases. , (2019).
