Glycoconjugate homogéneo producido por la incorporación combinada de aminoácidos antinaturales y la química de clics para fines de vacunas
Summary
La expansión del código genético se aplica para la introducción de un aminoácido antinatural que lleva un grupo funcional biorthogonal en una proteína portadora en un sitio definido. La función biorthogonal se utiliza además para el acoplamiento selectivo del sitio de un antígeno de carbohidratos para proporcionar una vacuna de glucoconjugado homogénea.
Abstract
La expansión del código genético es una poderosa herramienta para introducir aminoácidos antinaturales (UAAs) en proteínas para modificar sus características, estudiar o crear nuevas funciones proteicas o tener acceso a conjugados proteicos. Detener la supresión del codón, en particular la supresión del codón de ámbar, ha surgido como el método más popular para introducir genéticamente uaas en posiciones definidas. Esta metodología se aplica en este documento a la preparación de una proteína portadora que contiene una UAA que alberga un grupo funcional bioortohogonal. Este mango reactivo se puede utilizar a continuación para injertar de forma específica y eficiente un hapten sintético de oligosacárido para proporcionar una vacuna de glicoconjugado homogénea. El protocolo se limita a la síntesis de glucoconjugados en una proporción de proteína de hapten/portador de carbohidratos 1:1, pero susceptible a numerosos pares de grupos funcionales biorthogonales. La homogeneidad de la vacuna glucococonjugada es un criterio importante para garantizar una caracterización fisicoquímica completa, satisfaciendo así las recomendaciones cada vez más exigentes de los organismos reguladores de medicamentos, un criterio que no se cumple con las estrategias clásicas de conjugación. Además, este protocolo permite ajustar con precisión la estructura de la vacuna conjugada real, dando lugar a herramientas para abordar las relaciones estructura-inmunogenicidad.
Introduction
Las vacunas contra el glicoconjugado son elementos esenciales del arsenal de vacunas disponible para el tratamiento profiláctico de enfermedades infecciosas. Son seguros, bien tolerados y eficientes en un amplio grupo de edad, incluidos los bebés pequeños. Proporcionan la defensa óptima contra las infecciones causadas por bacterias capsuladas como meningococo, neumococo o Haemophilus influenzae tipo b1. Las vacunas glucococonjugate están hechas de polisacáridos bacterianos purificados que forman las cápsulas de bacterias o oligosacáridos sintéticos que imitan estos polisacáridos expresados en superficie2,que están covalentemente vinculados a una proteína portadora. La presencia de una proteína portadora es esencial para promover respuestas inmunitarias humorales protectoras dirigidas contra el determinante antigénico expresado por los antígenos de carbohidratos3. Aparte de una cuidadosa selección y producción del antígeno de carbohidratos, las características que se sabe que ejercen una influencia en la eficacia de una vacuna glucoconjugada son: la naturaleza de la proteína portadora, la química de conjugación (incluyendo la naturaleza y la longitud del vinculador si se utiliza), o la relación sacárido/proteína3. Obviamente, las posiciones en las que el sacárido se conjuga con la proteína, así como el número de puntos de conectividad son relevantes para la inmunogenicidad. Hasta la fecha, estos dos parámetros apenas se han estudiado porque la preparación de los glicoconjugados sigue siendo en gran medida empírica. Su síntesis generalmente se basa en el uso de funciones de amina o ácido carboxílico de, respectivamente, residuos de cadena lateral de lisina o ácido aspártico/glutámico presentes en la secuencia de proteína portadora. Esto no conduce a una sola sino a una mezcla heterogénea de glicoconjugados.
Jugar con la reactividad, accesibilidad o distribución de los residuos de aminoácidos en la proteína da lugar a glucoconjugados más definidos que son más fiables para documentar el efecto de la conectividad de sacárido/proteína4. Un paso adelante hacia este objetivo se puede lograr mediante la aplicación de la tecnología de acoplamiento de glicano proteico, un proceso recombinante que permite la producción de vacunas de glucoconjugado controlado en fábricas celulares5,6. Sin embargo, la glicosilación tiene lugar exclusivamente en un residuo de asparagina dentro de las secuoyas D/EXNYS/T (en la que X es cualquiera de los 20 aminoácidos naturales), no presente naturalmente en las proteínas portadoras.
La mutagénesis selectiva del sitio y, enparticular,la incorporación de cisteínas para explotar su alta y selectiva reactividad aparece como alternativa7,8. La producción de proteínas portadoras que incorporan UAAs en su secuencia puede ofrecer aún más flexibilidad para la preparación homogénea de vacunas con glucoconjugado. Más de 100 UAAs han sido desarrolladas e incorporadas en diversas proteínas9,10. Muchos de ellos contienen funciones bioortohogonales generalmente utilizadas para llevar a cabo modificaciones posteriores a la traducción11 o para injertar sondas biofísicas12 o fármacos13 pero que son mangos ideales para una conjugación adicional con antígenos de carbohidratos. Biotech14 ha reclamado ejemplos exitosos utilizando la síntesis de proteínas libres de células15, pero la preparación de vacunas de glucoconjugado de acuerdo con esta estrategia todavía espera a popularizarse.
La aplicación de la estrategia in vivo para la producción de proteína portadora mutada necesita una maquinaria traslacional modificada que incluya un codón específico, un ARN que reconozca el codón y un aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) que cataliza específicamente la transferencia de la UAA en el ARN (Figura 1)16. La supresión del codón de detención de ámbar pirro lisina es uno de los métodos más utilizados para incorporar UAA, en particular la propargyl-lisina (PrK)17. Este último a su vez puede reaccionar con haptens de carbohidratos azido-funcionalizados para proporcionar glucococonjugados homogéneos y totalmente definidos. En el presente manuscrito describimos cómo sintetizar el propargyl-L-lisina, un UAA que lleva un mango de alquina, cómo incorporarlo a una proteína diana durante su traducción en una bacteria y finalmente cómo realizar la conjugación entre la proteína modificada y un hapten que lleva una función de azide utilizando la química de clics.
Protocol
Representative Results
Discussion
La mutagénesis dirigida por el sitio es una estrategia sencilla para incorporar aminoácidos específicos en una posición definida de una proteína que apenas se utiliza con el objetivo de preparar vacunas de glicoconjugado7,8,14. La mutagénesis clásica basada en el enfoque de 20 aminoácidos naturales es altamente eficiente ya que no se requiere ninguna modificación de la maquinaria de traducción. Las mutaciones de la cis…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.C. agradece el apoyo financiero de La Région Pays de la Loire (Programa Pari Scientifique “BioSynProt”), en particular una beca doctoral para T.V. También reconocemos al Dr. Robert B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Toulouse, Francia) por sus valiosos consejos técnicos.
Materials
| AIM (autoinductif medium) | Formedium | AIMLB0210 | Solid powder |
| Boc-Lys-OH | Alfa-Aesar | H63859 | Solid powder |
| BL21(DE3) | Merck Novagen | 69450 | E. coli str. B, F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB–mB–) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS) |
| Dialysis membrane | |||
| DNAseI | |||
| Filter 0.45 µm | |||
| L-arabinose | |||
| lysozyme | |||
| Ni-NTA resin | Machery Nagel | Protino | Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol |
| Pall centrifugal device | |||
| pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH | this study | same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene | |
| pET24d-mPsaA-WT | this study | pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene | |
| pEVOL plasmid | gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19) | plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene | |
| Propargyl chloroformate | Sigma-Aldrich | 460923 | Liquid |
| Sonicator | Thermo Fisher | FB120-220 |
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