Dieses Protokoll beschreibt die Methode, Materialien, Ausrüstung und Schritte zur Bottom-up-Vorbereitung von RNA und Protein produzierenden synthetischen Zellen. Das innere wässrige Fach der synthetischen Zellen enthielt das in einer Lipid-Bilayer (d. h. stabile Liposomen) eingekapselte S30-Bakterienlysat, das mit einem Wasser-in-Öl-Emulsionstransferverfahren verkapselt war.
Der Bottom-up-Montageansatz für den Aufbau synthetischer Zellen ist ein effektives Werkzeug zur Isolierung und Untersuchung zellulärer Prozesse in einer Zellimittierungsumgebung. Darüber hinaus hat die Entwicklung zellfreier Expressionssysteme die Fähigkeit gezeigt, die Proteinproduktions-, Transkriptions- und Translationsprozesse (DNA-RNA-Protein) kontrolliert zu rekonstituieren und dabei die synthetische Biologie zu nutzen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Herstellung eines zellfreien Expressionssystems, einschließlich der Herstellung eines potenten bakteriellen Lysats und der Verkapselung dieses Lysats in cholesterinreichen Lipid-basierten Riesen-Unilamellar-Vesikeln (GUVs) (d.h. stabile Liposomen), um synthetische Zellen zu bilden. Das Protokoll beschreibt die Methoden zur Herstellung der Komponenten der synthetischen Zellen einschließlich der Herstellung von aktiven bakteriellen Lysaten, gefolgt von einer detaillierten schrittweisen Vorbereitung der synthetischen Zellen auf der Grundlage eines Wasser-in-Öl-Emulsionstransferverfahrens. Diese erleichtern die Produktion von Millionen synthetischer Zellen auf einfache und erschwingliche Weise mit einer hohen Vielseitigkeit für die Herstellung verschiedener Arten von Proteinen. Die erhaltenen synthetischen Zellen können verwendet werden, um die Protein-RNA-Produktion und -Aktivität in einer isolierten Umgebung zu untersuchen, in der gerichteten Evolution, und auch als kontrollierte Plattform für die Bereitstellung von Medikamenten für die On-Demand-Produktion von therapeutischen Proteinen im Körper.
Synthetische Zellen sind künstliche zellähnliche Teilchen, die eine oder mehrere Funktionen einer lebenden Zelle imitieren, wie z. B. die Fähigkeit, zu teilen, Membraninteraktionen zu bilden und Proteine basierend auf einem genetischen Code1,2,3zu synthetisieren. Synthetische Zellen, die zellfreie Proteinsynthesesysteme (CFPS) umschließen, besitzen eine hohe Modularität aufgrund ihrer Fähigkeit, verschiedene Proteine und RNA-Sequenzen nach Veränderungen in der DNA-Vorlage zu produzieren. Als attraktive Alternative zu den aktuellen Ansätzen der Proteinproduktion basieren CFPS-Systeme auf Zelllysat, gereinigten Komponenten oder synthetischen Komponenten und umfassen alle Transkriptions- und Übersetzungsmaschinen, die für die Proteinsynthese erforderlich sind, wie Ribosomen, RNA-Polymerase, Aminosäuren und Energiequellen (z. B. 3-Phosphoglycerat und Adenintriphosphat)8,4,5,6,7,9. Die Verkapselung eines CFPS-Systems in Lipidbläschen ermöglicht die einfache und effiziente Produktion von Proteinen, ohne von einer lebenden Zelle abhängig zu sein10. Darüber hinaus ermöglicht diese Plattform die Synthese von Peptiden, die in natürlichen Zellen abbauen können, Produktion von Proteinen, die toxisch für lebende Zellen sind, und modifizieren Proteine mit nicht-natürlichen Aminosäuren11,12. Synthetische Zellen wurden als Modell für Forschungszwecke verwendet, um die minimalen Zellkomponenten zu untersuchen, die erforderlich sind, um das zelluläre Leben aus evolutionärer Perspektive zu ermöglichen1,13. Synthetische Zellen wurden auch verwendet, um genetische Schaltung zu bauen und zu implementieren und als Modelle für gerichtete Evolution14,15,16. Andere Studien konzentrierten sich auf die Fähigkeit synthetischer Zellen, die biologische Aktivität natürlicher Zellen nachzuahmen, mit dem Ziel, beschädigte natürliche Zellen zu ersetzen, wie Betazellen bei Patienten mit Diabetes17. Darüber hinaus veranschaulicht die Fähigkeit dieser CFPS, synthetische Zellen zu verkapseln, eine Vielzahl von therapeutischen Proteinen zu produzieren, ihr Potenzial, in den klinischen Einsatz integriert zu werden18.
Hier beschreiben wir ein Bottom-up-Labor-Skalenprotokoll (Abbildung 1) zur Herstellung von RNA- und Protein produzierenden synthetischen Zellen auf Basis eines CFPS-Systems, das in einem Lipidvesikel eingekapselt ist. Dies zeigt die mögliche Verwendung synthetischer Zellplattformen als neuartige Wirkstoffabgabesysteme für die Vor-Ort-Produktion eines therapeutischen Proteinmedikaments in vivo19. Frühere Studien haben die Optimierung der CFPS-Reaktion und der Zelllysatpräparationsprozesse4,8,20untersucht. Darüber hinaus wurden verschiedene Techniken für die zellgroße Liposomenpräparation angewendet, wie mikrofluidische und polymerbasierte Tröpfchenstabilisierungsmethoden21,22,23, die sich auch in der Lipidzusammensetzung der Liposomen24,25,26unterscheiden. Im vorgestellten Protokoll werden synthetische Zellen nach einem Wasser-in-Öl-Emulsionstransferverfahren hergestellt und der Verkapselungsprozess bei niedrigen Temperaturen (<4 °C)5,10,24,27,28durchgeführt. Diese milden Bedingungen haben sich als günstig für die Beibehaltung der biofunktionellen Integrität der molekularen Maschinerie erwiesen, nämlich Ribosomen und Proteine27,29,30. Die Lipidzusammensetzung der Partikel besteht sowohl aus Cholesterin als auch aus 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (POPC). Die erste findet sich in allen Säugetierzellmembranen und ist wesentlich für die Stabilität, Steifigkeit und Durchlässigkeit der Membran, und letztere imitiert Säugetier Phospholipid Zusammensetzung11,13. Die zelluläre Transkription und Translation molekulare Maschinerie werden aus dem BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli) Stamm extrahiert, der mit pAR1219 Plasmid überexzierende T7-RNA-Polymerase umgewandelt wird, um die CFPS-Potenz und Proteinsynthese zu erhöhen. Dieses System wurde zur Herstellung diagnostischer und therapeutischer Proteine mit Molekulargewichten von bis zu 66 kDa in vitro und in vivo19,31verwendet. Das folgende Protokoll bietet eine einfache und effektive Methode zur Herstellung des synthetischen Zellsystems, die eine Vielzahl grundlegender Fragen im Zusammenhang mit der Proteinsynthese in der Natur angehen und auch für Arzneimittelabgabeanwendungen eingesetzt werden kann.
Mit diesem Protokoll wird eine einfache und erschwingliche Methode zur Herstellung großer Mengen proteinproduzierender synthetischer Zellen eingeführt. Die Ausbeute aktiver Zellen hängt von einer sorgfältigen und genauen Ausführung des Protokolls ab, wobei der Schwerpunkt auf mehreren kritischen Schritten liegt. Im Lysatpräparat dieser Methode ist es wichtig, die entsprechende Bakteriendichte vor der Zelllyse zu erreichen, um eine ausreichende Menge an Proteinen im bakteriellen Lysat zu erreichen. Zweitens sollte d…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von ERC-STG-2015-680242 unterstützt.
Die Autoren würdigen auch die Unterstützung des Technion Integrated Cancer Center (TICC); das Russell Berrie Nanotechnology Institute; das Lorry I. Lokey Interdisciplinary Center for Life Sciences & Engineering; das israelische Wirtschaftsministerium für einen Kamin-Zuschuss (52752); das israelische Ministerium für Wissenschaftstechnologie und Raumfahrt – Büro des Chefwissenschaftlers (3-11878); die Israel Science Foundation (1778/13, 1421/17); der Israel Cancer Association (2015-0116); die Deutsch-Israelische Stiftung für wissenschaftliche Forschung und Entwicklung für ein GIF-Young-Stipendium (I-2328-1139.10/2012); das FP-7 IRG-Programm der Europäischen Union für einen Stipendien für die berufliche Eingliederung (908049); das Phospholipid Research Center Grant; eine Rosenblatt Foundation for Cancer Research, ein Mallat Family Foundation Grant; und der Familienstiftung Unger. A. Schroeder würdigt Alon und Taub Fellowships. O. Adir würdigt die Sherman- und Gutwirth-Stipendien. G. Chen erkennt die Sherman Fellowship an. N. Krinsky würdigt das Baroness Ariane de Rothschild Women Doctoral Program der Rothschild Caesarea Foundation.
A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation) | |||
E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
pAR1219 | Sigma | T2076 | TargeTron vector for transformation. |
Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | Stored at -20 °C. |
10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate. |
10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
15 g/L Agar agar purified | Merck | 1.01614.5007 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL). |
10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
12 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L). |
24 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
4% (v/v) Glycerol anhydrous | Bio-Lab | 7120501 | |
2.32 g/L K2HPO4 | Spectrum chemical | P1383 | |
12.54 g/L KH2PO4 | Spectrum chemical | P1380 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT) | TCI | D1071 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 | Sigma | T1503 | S30 lysate buffer (1.5 L) |
14 mM magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | |
60 mM potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | |
1 mM DTT | TCI | D1071 | |
0.5 mL/L 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
Equipment required for step 1 | |||
100 mL sterilized Erlenmeyer flasks | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 flasks |
2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 flasks |
Floor incubator shaker | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) – Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g. * Pre-cooled to 4 °C. |
High pressure homogenizer | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | Pre-cooled to 4 °C. |
-80oC freezer | SO-LOW | U85-18 | |
Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
Spectrophotometer | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
96-well transparent plate | Thermo Scientific | 167008 | |
Sterilized graduated cylinder | Corning | ||
Sterilized centrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
Sterilized pipette tips | Corning | Preferably pre-cooled to -20 °C. | |
Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
Small liquid nitrogen tank | NALGENE | 4150-4000 | |
B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation): | |||
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | Powder |
Cholesterol | Sigma | C8667 | Powder |
Chloroform | Bio-Lab | 3082301 | |
Mineral oil | Sigma | M5904 | Light oil |
Equipment required for step 2 | |||
Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
Heating block | TECHNE | FDB03AD | Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature. |
2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator. |
9mm Screw Cap | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures): | |||
HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) – pH buffer |
Potassium hydroxide (KOH) | Frutarom | 55290 | |
1 M Magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | Co-factor and negative charge stabilizor. |
1 M Potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | Negative charge stabilizor. |
5.2 M Ammonium acetate | Merck | 1.01116.1000 | Stabilizes negative charge. |
50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Increases the concentration of the macromolecules. |
0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) | Sigma | P8877 | Secondary energy source. |
50 mM Amino acids mixture I | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17 natural amino acids – alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine. |
50 mM Amino acids mixture II | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids – tryptophan, phenylalanine, and tyrosine. |
100 mM Adenine triphosphate (ATP) | Sigma | A3377 | Nucleotides & energy source. |
50 mM Guanidine triphosphate (GTP) | Sigma | G8877 | Nucleotides & energy source. |
100 mM Uridine triphosphate (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Nucleotides additive. |
100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Genes expression induction. |
2 M Sucrose | J.T. Baker | 1933078 | Generating a density gradient. |
2 M Glucose | Sigma | 16301 | Generating a density gradient. |
H2O UltraPure Water (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase free |
S30-T7 lysate | _ | _ | Prepared at step 1. Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. |
Stock of DNA plasmid of choice | _ | _ | Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor |
D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation) | |||
Floor incubator shaker or Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
PHMT Grant Bio | PSC18 | Thermomixer | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) – TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C. |
Table centrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) – 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C. |
Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
Sterile 15 mL plastic tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | |
Sterilized pipette tips | Corning | Sterilized by autoclave. |