Preparazione di proteine che producono cellule sintetiche utilizzando estratti batterici cell free, liposomi e trasferimento di emulsione

Summary

Questo protocollo descrive il metodo, i materiali, le attrezzature e i passaggi per la preparazione bottom-up di RNA e proteine che producono cellule sintetiche. Il compartimento acquoso interno delle cellule sintetiche conteneva il lisato batterico S30 incapsulato all’interno di un bistrato lipidico (cioè liposomi stabili), utilizzando un metodo di trasferimento dell’emulsione dell’acqua-in-olio.

Abstract

L’approccio di assemblaggio bottom-up per la costruzione di cellule sintetiche è uno strumento efficace per isolare e studiare i processi cellulari in un ambiente di imitazione cellulare. Inoltre, lo sviluppo di sistemi di espressione senza cellule ha dimostrato la capacità di ricostituire i processi di produzione, trascrizione e traduzione delle proteine (DNA-RNA-proteina) in modo controllato, sfruttando la biologia sintetica. Qui descriviamo un protocollo per la preparazione di un sistema di espressione privo di cellule, compresa la produzione di un potente lisato batterico e incapsulando questo lisato all’interno di vescicle giganti di unilamellar a base di lipidi a base di colesterolo (GUV) (cioè liposomi stabili), per formare cellule sintetiche. Il protocollo descrive i metodi per preparare i componenti delle cellule sintetiche, compresa la produzione di lismi batterici attivi, seguiti da una preparazione dettagliata passo-passo delle cellule sintetiche sulla base di un metodo di trasferimento dell’emulsione acqua-in-olio. Questi facilitano la produzione di milioni di cellule sintetiche in modo semplice e conveniente con un’elevata versatilità per la produzione di diversi tipi di proteine. Le cellule sintetiche ottenute possono essere utilizzate per studiare la produzione e l’attività di proteine/RNA in un ambiente isolato, in evoluzione diretta, e anche come piattaforma di somministrazione controllata di farmaci per la produzione on demand di proteine terapeutiche all’interno del corpo.

Introduction

Le cellule sintetiche sono particelle artificiali simili a cellule, che imitano una o più funzioni di una cellula vivente, come la capacità di dividere, formare interazioni di membrana e sintetizzare proteine basate su un codice genetico^1,2,3. Le cellule sintetiche che racchiudono sistemi di sintesi proteica priva di cellule (CFPS) possiedono un’elevata modularità grazie alla loro capacità di produrre varie proteine e sequenze di RNA dopo alterazioni nel modello di DNA. Presentando un’alternativa interessante agli attuali approcci di produzione di proteine, i sistemi CFPS si basano su lisa cellule, componenti purificati o componenti sintetici e comprendono tutti i meccanismi di trascrizione e traduzione necessari per la sintesi proteica come ribosomi, RNA polymerasi, aminoacidi e fonti energetiche (ad esempio, 3-fosforocifo e tripofosfato adenina)^4,5,6,7,,^8,. L’incapsulamento di un sistema CFPS all’interno di vescicoli lipidi consente la produzione semplice ed efficiente di proteine senza dipendere da una cellula vivente¹⁰. Inoltre, questa piattaforma permette la sintesi di peptidi che possono degradare all’interno delle cellule naturali, produzione di proteine tossiche per le cellule viventi, e modificare le proteine con aminoacidi non naturali^11,12. Le cellule sintetiche sono state utilizzate come modello per scopi di ricerca studiando i componenti cellulari minimi necessari per consentire la vita cellulare da una prospettiva evolutiva^1,13. Le cellule sintetiche sono state utilizzate anche per costruire e implementare circuiti genetici e come modelli per l’evoluzione diretta^14,15,16. Altri studi si sono concentrati sulla capacità delle cellule sintetiche di imitare l’attività biologica delle cellule naturali, con l’obiettivo di sostituire le cellule naturali danneggiate, come le cellule beta in pazienti con diabete¹⁷. Inoltre, la capacità di questi CFPS che incapsulano le cellule sintetiche di produrre una varietà di proteine terapeutiche illustra il suo potenziale per essere incorporato nell’uso clinico¹⁸.

Qui descriviamo un protocollo di laboratorio-scala dal basso verso l’alto (Figura 1) per la produzione di RNA e cellule sintetiche che producono proteine sulla base di un sistema CFPS incapsulato in una vescicola lipidica. Questo dimostra il potenziale uso di piattaforme di cellule sintetiche come nuovi sistemi di somministrazione di farmaci per la produzione in loco di un farmaco terapeutico proteico in vivo¹⁹. Studi precedenti hanno studiato l’ottimizzazione della reazione CFPS e i processi di preparazione del lisato cellulare^4,8,20. Inoltre, sono state applicate diverse tecniche per la preparazione del liposoma di dimensioni cellulari, come i metodi di stabilizzazione delle goccioline microfluidiche e polimeriche^21,22,23, che differiscono anche nella composizione lipida dei liposomi^24,25,26. Nel protocollo presentato, le cellule sintetiche vengono prodotte utilizzando un metodo di trasferimento dell’emulsione dell’acqua e dell’olio e il processo di incapsulamento viene eseguito a basse temperature (<4 ))^{5,10,24,27,28}. Queste condizioni lievi sono state trovate per essere favorevoli per mantenere l’integrità bio-funzionale del macchinario molecolare, vale a dire ribosomi e proteine^27,29,30. La composizione lipidica delle particelle è costituita sia da colesterolo che da 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC). Il primo si trova in tutte le membrane cellulari dei mammiferi ed è essenziale per la stabilità, rigidità e riduzione della permeabilità della membrana, e quest’ultimo imita la composizione fosforlipide mammifera^11,13. La trascrizione cellulare e la macchina molecolare di traslazione vengono estratte dal ceppo BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli), che viene trasformato con pAR1219 plasmide sovraesprimendo la polimerasi dell’RNA T7 per aumentare la potenza CFPS e la sintesi proteica. Questo sistema è stato utilizzato per produrre proteine diagnostiche e terapeutiche, con pesi molecolari fino a 66 kDa in vitro e in vivo^19,31. Il seguente protocollo fornisce un metodo semplice ed efficace per la produzione del sistema di cellule sintetiche, che può affrontare una vasta gamma di questioni fondamentali associate alla sintesi proteica in natura e può essere utilizzato anche per applicazioni di somministrazione di farmaci.

Protocol

NOTA: l’illustrazione del protocollo di produzione completo delle cellule sintetiche è illustrata nella Figura 1. In base alle esigenze dell’utente, l’espressione proteica (sezione 3.2) e le parti di formazione di cellule sintetiche (sezione 4) del protocollo possono anche essere eseguite in modo indipendente (con alcuni adattamenti). 1. Preparazione di LisaS30-T7 Streak placcare i batteri E. coli BL21(DE3) trasformati con la polimerasi T7 RNA …

Representative Results

Presentiamo un protocollo per la preparazione di cellule sintetiche incapsulando un sistema S30-T7 CFPS basato su BL21 E. coli all’interno di vescicle lipidiche. Nella figura 2viene presentata una descrizione schematica del processo di preparazione che include un’immagine di ogni fase. Il successo del processo di preparazione delle cellule sintetiche dipende dalle prestazioni appropriate di ogni fase ed eseguito da diversi parametri. Il protocollo deve essere regolato per accogliere…

Discussion

Questo protocollo introduce un metodo semplice e conveniente per la produzione di grandi quantità di cellule sintetiche che producono proteine. La resa delle cellule attive dipende da un’attenta e accurata esecuzione del protocollo con particolare attenzione a diversi passaggi critici. Nella sezione di preparazione del lisa di questo metodo, è essenziale raggiungere la densità di batteri appropriata prima della lisi cellulare per ottenere una quantità sufficiente di proteine nel lisato batterico. In secondo luogo, il…

Materials

A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation)
E.coli BL21 (DE3)	NEB	C2527	E.coli BL21 (DE3).
pAR1219	Sigma	T2076	TargeTron vector for transformation.
Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin	Sigma	A9518	Stored at -20 °C.
10 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate.
10 g/L Sodium chloride (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
15 g/L Agar agar purified	Merck	1.01614.5007
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
10 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL).
10 g/L Sodium chloride (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
12 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L).
24 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
4% (v/v) Glycerol anhydrous	Bio-Lab	7120501
2.32 g/L K2HPO4	Spectrum chemical	P1383
12.54 g/L KH2PO4	Spectrum chemical	P1380
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT)	TCI	D1071	Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
10 mM Tris-acetate at pH = 7.4	Sigma	T1503	S30 lysate buffer (1.5 L)
14 mM magnesium acetate	Merck	1.05819.0250
60 mM potassium acetate	Carlo Erba	470147
1 mM DTT	TCI	D1071
0.5 mL/L 2-mercaptoethanol	Sigma	M6250
Equipment required for step 1
100 mL sterilized Erlenmeyer flasks	Thermo Scientific	50-154-2846	2 flasks
2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles	KIMAX-KIMBLE	25630	2 flasks
Floor incubator shaker	MRC	TOU-120-2	Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
Centrifuge	Thermo Scientific	75004270	(75003340) – Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g.     * Pre-cooled to 4 °C.
High pressure homogenizer	AVESTIN	EmulsiFlex-C3	Pre-cooled to 4 °C.
-80oC freezer	SO-LOW	U85-18
Sterilized 1.5 mL plastic tubes	Eppendorf	30120086	Preferably pre-cooled to -20 °C.
Spectrophotometer	TECAN	IN-MNANO	Infinite M200 pro
96-well transparent plate	Thermo Scientific	167008
Sterilized graduated cylinder	Corning
Sterilized centrifuge tubes	Eppendorf	30120086	Preferably pre-cooled to -20 °C.
Sterilized pipette tips	Corning		Preferably pre-cooled to -20 °C.
Crushed ice bucket	Bel-Art	M18848-4001
Small liquid nitrogen tank	NALGENE	4150-4000
B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation):
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Lipoid	556400	Powder
Cholesterol	Sigma	C8667	Powder
Chloroform	Bio-Lab	3082301
Mineral oil	Sigma	M5904	Light oil
Equipment required for step 2
Vortex mixer	Scientific industries	SI-0256
Heating block	TECHNE	FDB03AD	Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature.
2 mL screw neck glass vials	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232	For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator.
9mm Screw Cap	CSI Analytical Innovations	C395R-09LC
C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures):
HEPES	Spectrum	H1089	1 M HEPES-KOH (pH = 8) – pH buffer
Potassium hydroxide (KOH)	Frutarom	55290
1 M Magnesium acetate	Merck	1.05819.0250	Co-factor and negative charge stabilizor.
1 M Potassium acetate	Carlo Erba	470147	Negative charge stabilizor.
5.2 M Ammonium acetate	Merck	1.01116.1000	Stabilizes negative charge.
50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG)	Merck	8.07491.1000	Increases the concentration of the macromolecules.
0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA)	Sigma	P8877	Secondary energy source.
50 mM Amino acids mixture I	Sigma	LAA21-1KT	Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17  natural amino acids – alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine.
50 mM Amino acids mixture II	Sigma	LAA21-1KT	Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids – tryptophan, phenylalanine, and tyrosine.
100 mM Adenine triphosphate (ATP)	Sigma	A3377	Nucleotides & energy source.
50 mM Guanidine triphosphate (GTP)	Sigma	G8877	Nucleotides & energy source.
100 mM Uridine triphosphate (UTP)	ACROS ORGANICS	226310010	Nucleotides additive.
100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Genes expression induction.
2 M Sucrose	J.T. Baker	1933078	Generating a density gradient.
2 M Glucose	Sigma	16301	Generating a density gradient.
H2O UltraPure Water (UPW)	Bio-Lab	2321777500	DNase & RNase free
S30-T7 lysate	_	_	Prepared at step 1.                                                                        Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage.
Stock of DNA plasmid of choice	_	_	Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor
D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation)
Floor incubator shaker or Thermomixer	MRC	TOU-120-2	Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
	PHMT Grant Bio	PSC18	Thermomixer
Centrifuge	Thermo Scientific	75004270	(75003629) – TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C.
Table centrifuge	Thermo Scientific	75002420	(75003424) – 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C.
Vortex mixer	Scientific industries	SI-0256
Crushed ice bucket	Bel-Art	M18848-4001
2 mL screw neck glass vials	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232
Sterile 15 mL plastic tubes	Thermo Scientific	339651
Sterilized 1.5 mL plastic tubes	Eppendorf	30120086
Sterilized pipette tips	Corning		Sterilized by autoclave.