Forbereder proteinproduserende syntetiske celler ved hjelp av cellefrie bakterielle ekstrakter, liposomer og emulsjonsoverføring

Summary

Denne protokollen beskriver metoden, materialer, utstyr og trinn for nedenfra og opp forberedelse av RNA og proteinproduserende syntetiske celler. Det indre akdige rommet i de syntetiske cellene inneholdt S30 bakteriell lysat innkapslet i en lipid bilayer (dvs. stabile liposomer), ved hjelp av en vann-i-olje emulsjon overføringsmetode.

Abstract

Nedenfra og opp montering tilnærming for bygging av syntetiske celler er et effektivt verktøy for å isolere og undersøke cellulære prosesser i en celle etterligne miljø. Videre har utviklingen av cellefrie uttrykkssystemer vist evnen til å rekonstituere proteinproduksjon, transkripsjon og oversettelsesprosesser (DNA→ RNA→protein) på en kontrollert måte, og utnytte syntetisk biologi. Her beskriver vi en protokoll for å forberede et cellefritt uttrykkssystem, inkludert produksjon av en potent bakteriell lysat og innkapsling av denne lysaten inne i kolesterolrike lipidbaserte, unilamellære vesikler (GUVs) (dvs. stabile liposomer), for å danne syntetiske celler. Protokollen beskriver metodene for å forberede komponentene i de syntetiske cellene, inkludert produksjon av aktive bakterielle lysater, etterfulgt av en detaljert trinnvis forberedelse av syntetiske celler basert på en vann-i-olje emulsjon overføringsmetode. Disse letter produksjonen av millioner av syntetiske celler på en enkel og rimelig måte med høy allsidighet for å produsere forskjellige typer proteiner. De oppnådde syntetiske cellene kan brukes til å undersøke protein/RNA-produksjon og aktivitet i et isolert miljø, i rettet evolusjon, og også som en kontrollert legemiddelleveringsplattform for behovsbetinget produksjon av terapeutiske proteiner inne i kroppen.

Introduction

Syntetiske celler er kunstige cellelignende partikler, etterligner en eller flere funksjoner i en levende celle, for eksempel evnen til å dele, danne membraninteraksjoner og syntetisere proteiner basert på en genetisk kode^1,2,3. Syntetiske celler som omslutter cellefrie proteinsyntese (CFPS)-systemer har høy modularitet på grunn av deres evne til å produsere ulike proteiner og RNA-sekvenser etter endringer i DNA-malen. Ved å presentere et attraktivt alternativ til de nåværende tilnærmingene til proteinproduksjon, er CFPS-systemer basert på cellelysat, rensede komponenter eller syntetiske komponenter og inkluderer alle transkripsjons- og oversettelsesmaskiner som kreves for proteinsyntese som ribosomer, RNA-polymerase, aminosyrer og energikilder (f.eks. 3-fosforlykemat og adenintriphosfat)^4,5,6,7,8,9. Innkapslingen av et CFPS-system inne i lipidvesikler muliggjør enkel og effektiv produksjon av proteiner uten å være avhengig av en levende celle¹⁰. Videre tillater denne plattformen syntese av peptider som kan forringes inne i naturlige celler, produksjon av proteiner som er giftige for levende celler, og endre proteiner med ikke-naturlige aminosyrer^11,12. Syntetiske celler har blitt brukt som en modell for forskningsformål som undersøker de minimale cellekomponentene som kreves for å muliggjøre cellulær liv fra et evolusjonært perspektiv^1,13. Syntetiske celler har også blitt brukt til å bygge og implementere genetisk krets og som modeller for rettet evolusjon^14,15,16. Andre studier har fokusert på evnen til syntetiske celler for å etterligne den biologiske aktiviteten til naturlige celler, med sikte på å erstatte skadede naturlige celler, for eksempel betaceller hos pasienter med diabetes¹⁷. Videre illustrerer evnen til disse CFPS-innkapslingssyntetiske cellene til å produsere en rekke terapeutiske proteiner sitt potensial til å bli innlemmet i klinisk bruk¹⁸.

Her beskriver vi en bunn-opp lab-skala protokoll (Figur 1) for produksjon av RNA og proteinproduserende syntetiske celler basert på et CFPS-system innkapslet i en lipid vesikkel. Dette viser den potensielle bruken av syntetiske celleplattformer som nye legemiddelleveringssystemer for produksjon av et terapeutisk proteinstoff in vivo¹⁹. Tidligere studier har undersøkt optimalisering av CFPS-reaksjonen og cellelysate forberedelsesprosessene^4,8,20. Videre har flere teknikker blitt brukt for cellestørrelse liposom forberedelse, for eksempel mikrofluidiske og polymer-baserte dråpestabiliseringsmetoder^21,22,23, som også varierer i liposomenes lipidsammensetning^24,25,26. I den presenterte protokollen produseres syntetiske celler ved hjelp av en overføringsmetode for vann-i-olje-emulsjon, og innkapslingsprosessen utføres ved lave temperaturer (<4 °C)^{5,,10,,24,27,28}. Disse milde forholdene har vist seg å være gunstige for å beholde den biofunksjonelle integriteten til molekylærmaskineriet, nemlig ribosomer og proteiner^27,,29,30. Lipidsammensetningen av partiklene består av både kolesterol og 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (POPC). Den første finnes i alle pattedyrcellemembraner og er avgjørende for stabilitet, stivhet og permeabilitetsreduksjon av membranen, og sistnevnte etterligner pattedyrfolipidsammensetning^11,13. Den cellulære transkripsjonen og oversettelsesmolekylære maskineriet ekstraheres fra BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli) stamme, som er forvandlet med pAR1219 plasmid overexpressing T7 RNA polymerase for å øke CFPS potens og proteinsyntese. Dette systemet har blitt brukt til å produsere diagnostiske og terapeutiske proteiner, med molekylvekter på opptil 66 kDa in vitro og in vivo^19,31. Følgende protokoll gir en enkel og effektiv metode for produksjon av det syntetiske cellesystemet, som kan løse et bredt spekter av grunnleggende spørsmål knyttet til proteinsyntese i naturen og kan også brukes til narkotikaleveringsapplikasjoner.

Protocol

MERK: Illustrasjon av de komplette syntetiske cellenes produksjonsprotokoll er presentert i figur 1. I henhold til brukerens behov kan proteinuttrykket (avsnitt 3.2) og syntetiskcelledannelse (avsnitt 4) deler av protokollen også utføres uavhengig (med noen tilpasninger). 1. Utarbeidelse av S30-T7 lysate Strekplate E. coli BL21(DE3) bakterier forvandlet med T7 RNA polymerase uttrykker pAR1219 plasmid på en LB-agar plate supplert med 50 μg / …

Representative Results

Vi presenterer en protokoll for fremstilling av syntetiske celler ved å innkapsle et S30-T7 CFPS-system basert på BL21 E. coli inne i lipidvesikler. En skjematisk beskrivelse av forberedelsesprosessen som inneholder et bilde av hvert trinn, presenteres i figur 2. Suksessen til den syntetiske celleklargjøringsprosessen er avhengig av riktig ytelse for hvert trinn og påvirket av forskjellige parametere. Protokollen bør justeres for å imøtekomme produksjonen av et bestemt protei…

Discussion

Denne protokollen introduserer en enkel og rimelig metode for produksjon av store mengder proteinproduserende syntetiske celler. Avkastningen av aktive celler er avhengig av forsiktig og nøyaktig gjennomføring av protokollen med vekt på flere kritiske trinn. I lysate forberedelsedelen av denne metoden er det viktig å nå riktig bakterietetthet før cellelysis for å oppnå en tilstrekkelig mengde proteiner i bakterielysatet. For det andre bør lysisprosessen utføres ved 4 °C og lysatet frosset raskt med flytende ni…

Materials

A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation)
E.coli BL21 (DE3)	NEB	C2527	E.coli BL21 (DE3).
pAR1219	Sigma	T2076	TargeTron vector for transformation.
Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin	Sigma	A9518	Stored at -20 °C.
10 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate.
10 g/L Sodium chloride (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
15 g/L Agar agar purified	Merck	1.01614.5007
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
10 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL).
10 g/L Sodium chloride (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
12 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L).
24 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
4% (v/v) Glycerol anhydrous	Bio-Lab	7120501
2.32 g/L K2HPO4	Spectrum chemical	P1383
12.54 g/L KH2PO4	Spectrum chemical	P1380
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT)	TCI	D1071	Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
10 mM Tris-acetate at pH = 7.4	Sigma	T1503	S30 lysate buffer (1.5 L)
14 mM magnesium acetate	Merck	1.05819.0250
60 mM potassium acetate	Carlo Erba	470147
1 mM DTT	TCI	D1071
0.5 mL/L 2-mercaptoethanol	Sigma	M6250
Equipment required for step 1
100 mL sterilized Erlenmeyer flasks	Thermo Scientific	50-154-2846	2 flasks
2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles	KIMAX-KIMBLE	25630	2 flasks
Floor incubator shaker	MRC	TOU-120-2	Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
Centrifuge	Thermo Scientific	75004270	(75003340) – Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g.     * Pre-cooled to 4 °C.
High pressure homogenizer	AVESTIN	EmulsiFlex-C3	Pre-cooled to 4 °C.
-80oC freezer	SO-LOW	U85-18
Sterilized 1.5 mL plastic tubes	Eppendorf	30120086	Preferably pre-cooled to -20 °C.
Spectrophotometer	TECAN	IN-MNANO	Infinite M200 pro
96-well transparent plate	Thermo Scientific	167008
Sterilized graduated cylinder	Corning
Sterilized centrifuge tubes	Eppendorf	30120086	Preferably pre-cooled to -20 °C.
Sterilized pipette tips	Corning		Preferably pre-cooled to -20 °C.
Crushed ice bucket	Bel-Art	M18848-4001
Small liquid nitrogen tank	NALGENE	4150-4000
B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation):
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Lipoid	556400	Powder
Cholesterol	Sigma	C8667	Powder
Chloroform	Bio-Lab	3082301
Mineral oil	Sigma	M5904	Light oil
Equipment required for step 2
Vortex mixer	Scientific industries	SI-0256
Heating block	TECHNE	FDB03AD	Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature.
2 mL screw neck glass vials	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232	For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator.
9mm Screw Cap	CSI Analytical Innovations	C395R-09LC
C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures):
HEPES	Spectrum	H1089	1 M HEPES-KOH (pH = 8) – pH buffer
Potassium hydroxide (KOH)	Frutarom	55290
1 M Magnesium acetate	Merck	1.05819.0250	Co-factor and negative charge stabilizor.
1 M Potassium acetate	Carlo Erba	470147	Negative charge stabilizor.
5.2 M Ammonium acetate	Merck	1.01116.1000	Stabilizes negative charge.
50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG)	Merck	8.07491.1000	Increases the concentration of the macromolecules.
0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA)	Sigma	P8877	Secondary energy source.
50 mM Amino acids mixture I	Sigma	LAA21-1KT	Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17  natural amino acids – alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine.
50 mM Amino acids mixture II	Sigma	LAA21-1KT	Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids – tryptophan, phenylalanine, and tyrosine.
100 mM Adenine triphosphate (ATP)	Sigma	A3377	Nucleotides & energy source.
50 mM Guanidine triphosphate (GTP)	Sigma	G8877	Nucleotides & energy source.
100 mM Uridine triphosphate (UTP)	ACROS ORGANICS	226310010	Nucleotides additive.
100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Genes expression induction.
2 M Sucrose	J.T. Baker	1933078	Generating a density gradient.
2 M Glucose	Sigma	16301	Generating a density gradient.
H2O UltraPure Water (UPW)	Bio-Lab	2321777500	DNase & RNase free
S30-T7 lysate	_	_	Prepared at step 1.                                                                        Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage.
Stock of DNA plasmid of choice	_	_	Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor
D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation)
Floor incubator shaker or Thermomixer	MRC	TOU-120-2	Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
	PHMT Grant Bio	PSC18	Thermomixer
Centrifuge	Thermo Scientific	75004270	(75003629) – TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C.
Table centrifuge	Thermo Scientific	75002420	(75003424) – 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C.
Vortex mixer	Scientific industries	SI-0256
Crushed ice bucket	Bel-Art	M18848-4001
2 mL screw neck glass vials	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232
Sterile 15 mL plastic tubes	Thermo Scientific	339651
Sterilized 1.5 mL plastic tubes	Eppendorf	30120086
Sterilized pipette tips	Corning		Sterilized by autoclave.