Подготовка белка Производство синтетических клеток с использованием клеток бесплатные бактериальные экстракты, липосомы и эмульсии передачи
Summary
Этот протокол описывает метод, материалы, оборудование и шаги для подготовки РНК и белка, производящих синтетические клетки. Внутренний водный отсек синтетических клеток содержал бактериальный лизат S30, инкапсулированный в липидный двухслойный (т.е. стабильные липосомы), используя метод переноса эмульсии воды в масле.
Abstract
Подход снизу вверх для сборки синтетических клеток является эффективным инструментом для изоляции и исследования клеточных процессов в клеточной среде. Кроме того, развитие систем самовыражения без клеток продемонстрировало способность к восстановлению производства белков, транскрипции и процессов перевода (ДНК-РНК-белок) контролируемым образом, используя синтетическую биологию. Здесь мы описываем протокол для подготовки системы свободного выражения клеток, в том числе производство мощного бактериального лизата и инкапсуляции этого лизата внутри богатых холестерином липидов на основе гигантских пузырьков (GUV) (т.е. стабильные липосомы), чтобы сформировать синтетические клетки. Протокол описывает методы подготовки компонентов синтетических клеток, включая производство активных бактериальных лизатов, с последующим детальным поэтапным препаратом синтетических клеток на основе метода переноса эмульсии воды в масле. Они облегчают производство миллионов синтетических клеток в простой и доступной манере с высокой универсальностью для производства различных типов белков. Полученные синтетические клетки могут быть использованы для исследования производства белка/РНК и деятельности в изолированной среде, в направленной эволюции, а также в качестве контролируемой платформы доставки лекарств для производства терапевтических белков внутри организма по требованию.
Introduction
Синтетические клетки являются искусственными клетками, как частицы, имитирующие одну или несколько функций живой клетки, такие как способность делиться, формировать мембранные взаимодействия, и синтезировать белки на основе генетического кода1,2,3. Синтетические клетки, которые прилагают системы синтеза белка без клеток (CFPS), обладают высокой модульностью из-за их способности производить различные белки и рнковые последовательности после изменений в шаблоне ДНК. Представляя привлекательную альтернативу современным подходам к производству белка, системы CFPS основаны на клеточном лицезе, очищенных компонентах или синтетических компонентах и включают в себя все транскрипции и переводческих механизмов, необходимых для синтеза белка, таких как рибосомы, РНК-полимераза, аминокислоты и источники энергии (например, 3-фосфогцерат7,8,9и аденина трифосфат)4,5,69 , 9 , 9 , 9,9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , 9 , Инкапсуляция системы CFPS внутри липидных пузырьков позволяет просто и эффективно производить белки без зависимости от живой клетки10. Кроме того, эта платформа позволяет синтез пептидов, которые могут деградировать внутри естественных клеток, производство белков, которые являются токсичными для живых клеток, и модифицировать белки с неестественными аминокислотами11,12. Синтетические клетки были использованы в качестве модели для исследовательских целей исследования минимальных компонентов клеток, необходимых для обеспечения клеточной жизни с эволюционной точки зрения1,13. Синтетические клетки также были использованы для создания и реализации генетической цепи и в качестве моделей для направленной эволюции14,15,16. Другие исследования были сосредоточены на способности синтетических клеток имитировать биологическую активность естественных клеток, с целью заменить поврежденные естественные клетки, такие как бета-клетки у пациентов с диабетом17. Кроме того, способность этих CFPS инкапсулировать синтетические клетки для производства различных терапевтических белков иллюстрирует его потенциал, чтобы быть включены в клиническое использование18.
Здесь мы описываем протокол лабораторного масштаба снизу вверх(рисунок 1)для производства РНК и белково-производящих синтетических клеток на основе системы CFPS, инкапсулированной в липидной везикуле. Это показывает потенциальное использование синтетических клеточных платформ в качестве новых систем доставки лекарств для производства терапевтического белка препарата in vivo19. Предыдущие исследования исследовали оптимизацию реакции CFPS и процессы подготовки лизата клетки4,,8,,20. Кроме того, некоторые методы были применены для клеточного размера липосомы подготовки, таких как микрофлюидные и полимерной основе капель стабилизации методы21,22,23, которые также отличаются в липидном составе липосомы липосом24,25,26. В представленном протоколе синтетические клетки производятся с использованием метода переноса эмульсии воды в масле, а инкапсуляция осуществляется при низких температурах (Злт; 4 КС)5,,10,,24,,27,28. Эти мягкие условия были признаны благоприятными для сохранения биофункциональной целостности молекулярного механизма, а именно рибосом и белков27,,29,30. Липидный состав частиц состоит как из холестерина, так и из 1-пальмитоила-2-олеойл-сн-глицеро-3-фосфохолина (ПОПК). Первый находится во всех мембранах клеток млекопитающих и имеет важное значение для стабильности, жесткости и проницаемости сокращения мембраны, а последний имитирует млекопитающего фосфолипидного состава11,13. Клеточная транскрипция и перевод молекулярного механизма извлекаются из штамма BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli), который преобразуется с pAR1219 плазмид, переэкспрессирующий полимеразу T7 РНК для увеличения потенции CFPS и синтеза белка. Эта система была использована для производства диагностических и терапевтических белков, с молекулярными весами до 66 kDa in vitro и in vivo19,31. Следующий протокол обеспечивает простой и эффективный метод для производства синтетической клеточной системы, который может решить широкий спектр фундаментальных вопросов, связанных с синтезом белка в природе, а также может быть использован для применения наркотиков.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол вводит простой и доступный метод для производства больших количеств белково-производящих синтетических клеток. Урожайность активных ячеек зависит от тщательного и точного выполнения протокола с акцентом на несколько критических шагов. В разделе подготовки лизата этог?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана ERC-STG-2015-680242.
Авторы также признают поддержку Центра интегрированного рака Technion (TICC); Институт нанотехнологий Рассела Берри; Лорри И. Локи Междисциплинарный центр наук и инженерии о жизни; министерство экономики Израиля за грант Камин (52752); Министерство науки и космонавтики Израиля – Канцелярия главного ученого (3-11878); Израильский научный фонд (1778/13, 1421/17); Израильская онкологическая ассоциация (2015-0116); Немецко-израильский фонд научных исследований и разработок для гранта GIF Young (I-2328-1139.10/2012); программа Европейского союза FP-7 IRG для гранта на профессиональную интеграцию (908049); Фосалипидский исследовательский центр Грант; Фонд Розенблатта по изучению рака, грант Фонда семьи Маллат; и Фонд семьи Унгер. А. Шредер признает алон и Тауб стипендий. О. Адир признает стипендии Шермана и Гутвирта. Г. Чэнь признает стипендию Шермана. Н. Крински признает баронесса Ариан де Ротшильд женщин докторской программы от Ротшильд Кесарево фонда.
Materials
| A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation) | |||
| E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
| pAR1219 | Sigma | T2076 | TargeTron vector for transformation. |
| Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | Stored at -20 °C. |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate. |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 15 g/L Agar agar purified | Merck | 1.01614.5007 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL). |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 12 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L). |
| 24 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 4% (v/v) Glycerol anhydrous | Bio-Lab | 7120501 | |
| 2.32 g/L K2HPO4 | Spectrum chemical | P1383 | |
| 12.54 g/L KH2PO4 | Spectrum chemical | P1380 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT) | TCI | D1071 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| 10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 | Sigma | T1503 | S30 lysate buffer (1.5 L) |
| 14 mM magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | |
| 60 mM potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | |
| 1 mM DTT | TCI | D1071 | |
| 0.5 mL/L 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Equipment required for step 1 | |||
| 100 mL sterilized Erlenmeyer flasks | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 flasks |
| 2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 flasks |
| Floor incubator shaker | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) – Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g. * Pre-cooled to 4 °C. |
| High pressure homogenizer | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | Pre-cooled to 4 °C. |
| -80oC freezer | SO-LOW | U85-18 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Spectrophotometer | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
| 96-well transparent plate | Thermo Scientific | 167008 | |
| Sterilized graduated cylinder | Corning | ||
| Sterilized centrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Sterilized pipette tips | Corning | Preferably pre-cooled to -20 °C. | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| Small liquid nitrogen tank | NALGENE | 4150-4000 | |
| B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation): | |||
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | Powder |
| Cholesterol | Sigma | C8667 | Powder |
| Chloroform | Bio-Lab | 3082301 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | Light oil |
| Equipment required for step 2 | |||
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Heating block | TECHNE | FDB03AD | Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature. |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator. |
| 9mm Screw Cap | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
| C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures): | |||
| HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) – pH buffer |
| Potassium hydroxide (KOH) | Frutarom | 55290 | |
| 1 M Magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | Co-factor and negative charge stabilizor. |
| 1 M Potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | Negative charge stabilizor. |
| 5.2 M Ammonium acetate | Merck | 1.01116.1000 | Stabilizes negative charge. |
| 50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Increases the concentration of the macromolecules. |
| 0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) | Sigma | P8877 | Secondary energy source. |
| 50 mM Amino acids mixture I | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17 natural amino acids – alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine. |
| 50 mM Amino acids mixture II | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids – tryptophan, phenylalanine, and tyrosine. |
| 100 mM Adenine triphosphate (ATP) | Sigma | A3377 | Nucleotides & energy source. |
| 50 mM Guanidine triphosphate (GTP) | Sigma | G8877 | Nucleotides & energy source. |
| 100 mM Uridine triphosphate (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Nucleotides additive. |
| 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Genes expression induction. |
| 2 M Sucrose | J.T. Baker | 1933078 | Generating a density gradient. |
| 2 M Glucose | Sigma | 16301 | Generating a density gradient. |
| H2O UltraPure Water (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase free |
| S30-T7 lysate | _ | _ | Prepared at step 1. Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. |
| Stock of DNA plasmid of choice | _ | _ | Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor |
| D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation) | |||
| Floor incubator shaker or Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| PHMT Grant Bio | PSC18 | Thermomixer | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) – TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C. |
| Table centrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) – 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C. |
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
| Sterile 15 mL plastic tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Sterilized pipette tips | Corning | Sterilized by autoclave. | |
Riferimenti
- Blain, J. C., Szostak, J. W. Progress toward synthetic cells. Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).
- Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).
- Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
- Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
- Stano, P. Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols. Chemistry-A European Journal. , (2019).
- Lewandowski, B., et al. Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine. Science. 339 (6116), 189-193 (2013).
- Li, J., et al. Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).
- Kim, T. W., et al. An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source. Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).
- Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. From DNA to protein: No living cells required. Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review. Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).
- Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
- Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).
- Arnold, F. H. Design by directed evolution. Accounts of Chemical Research. 31 (3), 125-131 (1998).
- Chen, Z., et al. Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion. Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).
- Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need. Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).
- Krinsky, N., et al. Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors. Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163 (2018).
- Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).
- Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models. Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
- Göpfrich, K., et al. One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells. ACS synthetic biology. , (2019).
- Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578 (2014).
- Periasamy, A., et al. Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs. Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).
- Kalmbach, R., et al. Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes. Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).
- Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
- Rampioni, G., et al. Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa. Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).
- Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. . Biosynthesis of proteins inside liposomes. , 127-145 (2010).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Krinsky, N., et al. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS One. 11 (10), 0165137 (2016).
- Pédelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79 (2006).
- Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).
- Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).
- Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. Journal of Visualized Experiments. , e54278 (2016).
- Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells. Scientific Reports. 7, 45167 (2017).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
