Preparación de células sintéticas productoras de proteínas mediante extractos bacterianos libres de células, liposomas y transferencia de emulsión

Summary

Este protocolo describe el método, los materiales, el equipo y los pasos para la preparación ascendente de ARN y células sintéticas productoras de proteínas. El compartimento acuoso interno de las células sintéticas contenía el lisato bacteriano S30 encapsulado dentro de una bicapa lipídica (es decir, liposomas estables), utilizando un método de transferencia de emulsión de agua en aceite.

Abstract

El enfoque de montaje ascendente para la construcción de células sintéticas es una herramienta eficaz para aislar e investigar procesos celulares en un entorno de imitación celular. Además, el desarrollo de sistemas de expresión sin células ha demostrado la capacidad de reconstituir los procesos de producción, transcripción y traducción de proteínas (ADN-ARN-proteína) de manera controlada, aprovechando la biología sintética. Aquí describimos un protocolo para preparar un sistema de expresión libre de células, incluyendo la producción de un potente lisado bacteriano y encapsular este liso dentro de vesículas unilamelares gigantes a base de lípidos ricos en colesterol (GUVs) (es decir, liposomas estables), para formar células sintéticas. El protocolo describe los métodos para preparar los componentes de las células sintéticas, incluida la producción de lisatos bacterianos activos, seguido de una preparación detallada paso a paso de las células sintéticas basada en un método de transferencia de emulsión de agua en aceite. Estos facilitan la producción de millones de células sintéticas de una manera sencilla y asequible con una alta versatilidad para producir diferentes tipos de proteínas. Las células sintéticas obtenidas se pueden utilizar para investigar la producción de proteínas/ARN y la actividad en un entorno aislado, en evolución dirigida, y también como una plataforma de administración controlada de fármacos para la producción bajo demanda de proteínas terapéuticas dentro del cuerpo.

Introduction

Las células sintéticas son partículas similares a células artificiales, imitando una o varias funciones de una célula viva, como la capacidad de dividir, formar interacciones de membrana y sintetizar proteínas basadas en un código genético^1,,2,3. Las células sintéticas que encierran sistemas de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) poseen una alta modularidad debido a su capacidad para producir varias proteínas y secuencias de ARN después de alteraciones en la plantilla de ADN. Presentando una alternativa atractiva a los enfoques actuales de la producción de proteínas, los sistemas CFPS se basan en lisato celular, componentes purificados o componentes sintéticos e incluyen toda la maquinaria de transcripción y traducción necesaria para la síntesis de proteínas como ribosomas, ARN polimerasa, aminoácidos y fuentes de energía (por ejemplo, 3-fosfoglicérido y trifosfato de adenina)^4,5,6,7,8,9. La encapsulación de un sistema CFPS dentro de vesículas lipídicas permite la producción simple y eficiente de proteínas sin depender de una célula viva¹⁰. Además, esta plataforma permite la síntesis de péptidos que pueden degradarse dentro de las células naturales, la producción de proteínas tóxicas para las células vivas, y modificar las proteínas con aminoácidos no naturales^11,,12. Las células sintéticas se han utilizado como modelo para fines de investigación que investigan los componentes celulares mínimos necesarios para permitir la vida celular desde una perspectiva evolutiva^1,,13. Las células sintéticas también se han utilizado para construir e implementar circuitos genéticos y como modelos para la evolución dirigida^14,,15,,16. Otros estudios se han centrado en la capacidad de las células sintéticas para imitar la actividad biológica de las células naturales, con el objetivo de reemplazar las células naturales dañadas, como las células beta en pacientes con diabetes^17. Además, la capacidad de estas células sintéticas encapsulantes CFPS para producir una variedad de proteínas terapéuticas ilustra su potencial para ser incorporadas en el uso clínico¹⁸.

Aquí describimos un protocolo de abajo hacia arriba a escala de laboratorio(Figura 1) para la producción de ARN y células sintéticas productoras de proteínas basadas en un sistema CFPS encapsulado en una vesícula lipídica. Esto muestra el uso potencial de plataformas celulares sintéticas como nuevos sistemas de administración de fármacos para la producción in situ de un fármaco de proteína terapéutica in vivo¹⁹. Estudios anteriores han investigado la optimización de la reacción CFPS y los procesos de preparación de lisato celular^4,8,20. Además, se han aplicado varias técnicas para la preparación de liposomas del tamaño de una célula, como los métodos de estabilización de gotas microfluídicas y a base de polímeros^21,22,23, que también difieren en la composición lipídica de los liposomas^24,25,26. En el protocolo presentado, las células sintéticas se producen utilizando un método de transferencia de emulsión de agua en aceite y el proceso de encapsulación se lleva a cabo a bajas temperaturas (<4 oC)^{5,10,24,27,28}. Se ha constatado que estas condiciones leves son favorables para conservar la integridad biofuncional de la maquinaria molecular, a saber, ribosomas y proteínas^27,,29,,30. La composición lipídica de las partículas consiste en colesterol y 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocolina (POPC). La primera se encuentra en todas las membranas celulares de los mamíferos y es esencial para la estabilidad, rigidez y reducción de la permeabilidad de la membrana, y la segunda imita la composición de fosfolípidos de mamíferos^11,,13. La transcripción celular y la maquinaria molecular de traducción se extraen de la cepa BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli), que se transforma con plásmido pAR1219 sobreexpresando la polimerasa de ARN T7 para aumentar la potencia de CFPS y la síntesis de proteínas. Este sistema se ha utilizado para producir proteínas diagnósticas y terapéuticas, con pesos moleculares de hasta 66 kDa in vitro e in vivo^19,,31. El siguiente protocolo proporciona un método simple y eficaz para la producción del sistema celular sintético, que puede abordar una amplia gama de cuestiones fundamentales asociadas con la síntesis de proteínas en la naturaleza y también se puede utilizar para aplicaciones de administración de fármacos.

Protocol

NOTA: La ilustración del protocolo de producción de las células sintéticas completas se presenta en la Figura 1. Según las necesidades del usuario, la expresión proteica (sección 3.2) y la formación de células sintéticas (sección 4) partes del protocolo también se pueden llevar a cabo de forma independiente (con algunas adaptaciones). 1. Preparación del lisado S30-T7 Placa de raya de la bacteria E. coli BL21(DE3) transformada con el…

Representative Results

Presentamos un protocolo para la preparación de células sintéticas encapsulando un sistema S30-T7 CFPS basado en BL21 E. coli dentro de las vesículas lipídicas. En la Figura 2se presenta una descripción esquemática del proceso de preparación que incluye una imagen de cada etapa. El éxito del proceso de preparación de células sintéticas depende del rendimiento adecuado de cada etapa y se realiza mediante diferentes parámetros. El protocolo debe ajustarse para adaptarse a…

Discussion

Este protocolo introduce un método simple y asequible para la producción de grandes cantidades de células sintéticas productoras de proteínas. El rendimiento de las células activas depende de una ejecución cuidadosa y precisa del protocolo con énfasis en varios pasos críticos. En la sección de preparación de lisados de este método, es esencial alcanzar la densidad bacteriana adecuada antes de la lisis celular para lograr una cantidad suficiente de proteínas en el lisato bacteriano. En segundo lugar, el proce…

Materials

A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation)
E.coli BL21 (DE3)	NEB	C2527	E.coli BL21 (DE3).
pAR1219	Sigma	T2076	TargeTron vector for transformation.
Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin	Sigma	A9518	Stored at -20 °C.
10 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate.
10 g/L Sodium chloride (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
15 g/L Agar agar purified	Merck	1.01614.5007
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
10 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL).
10 g/L Sodium chloride (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
12 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L).
24 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
4% (v/v) Glycerol anhydrous	Bio-Lab	7120501
2.32 g/L K2HPO4	Spectrum chemical	P1383
12.54 g/L KH2PO4	Spectrum chemical	P1380
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT)	TCI	D1071	Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
10 mM Tris-acetate at pH = 7.4	Sigma	T1503	S30 lysate buffer (1.5 L)
14 mM magnesium acetate	Merck	1.05819.0250
60 mM potassium acetate	Carlo Erba	470147
1 mM DTT	TCI	D1071
0.5 mL/L 2-mercaptoethanol	Sigma	M6250
Equipment required for step 1
100 mL sterilized Erlenmeyer flasks	Thermo Scientific	50-154-2846	2 flasks
2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles	KIMAX-KIMBLE	25630	2 flasks
Floor incubator shaker	MRC	TOU-120-2	Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
Centrifuge	Thermo Scientific	75004270	(75003340) – Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g.     * Pre-cooled to 4 °C.
High pressure homogenizer	AVESTIN	EmulsiFlex-C3	Pre-cooled to 4 °C.
-80oC freezer	SO-LOW	U85-18
Sterilized 1.5 mL plastic tubes	Eppendorf	30120086	Preferably pre-cooled to -20 °C.
Spectrophotometer	TECAN	IN-MNANO	Infinite M200 pro
96-well transparent plate	Thermo Scientific	167008
Sterilized graduated cylinder	Corning
Sterilized centrifuge tubes	Eppendorf	30120086	Preferably pre-cooled to -20 °C.
Sterilized pipette tips	Corning		Preferably pre-cooled to -20 °C.
Crushed ice bucket	Bel-Art	M18848-4001
Small liquid nitrogen tank	NALGENE	4150-4000
B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation):
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Lipoid	556400	Powder
Cholesterol	Sigma	C8667	Powder
Chloroform	Bio-Lab	3082301
Mineral oil	Sigma	M5904	Light oil
Equipment required for step 2
Vortex mixer	Scientific industries	SI-0256
Heating block	TECHNE	FDB03AD	Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature.
2 mL screw neck glass vials	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232	For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator.
9mm Screw Cap	CSI Analytical Innovations	C395R-09LC
C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures):
HEPES	Spectrum	H1089	1 M HEPES-KOH (pH = 8) – pH buffer
Potassium hydroxide (KOH)	Frutarom	55290
1 M Magnesium acetate	Merck	1.05819.0250	Co-factor and negative charge stabilizor.
1 M Potassium acetate	Carlo Erba	470147	Negative charge stabilizor.
5.2 M Ammonium acetate	Merck	1.01116.1000	Stabilizes negative charge.
50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG)	Merck	8.07491.1000	Increases the concentration of the macromolecules.
0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA)	Sigma	P8877	Secondary energy source.
50 mM Amino acids mixture I	Sigma	LAA21-1KT	Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17  natural amino acids – alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine.
50 mM Amino acids mixture II	Sigma	LAA21-1KT	Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids – tryptophan, phenylalanine, and tyrosine.
100 mM Adenine triphosphate (ATP)	Sigma	A3377	Nucleotides & energy source.
50 mM Guanidine triphosphate (GTP)	Sigma	G8877	Nucleotides & energy source.
100 mM Uridine triphosphate (UTP)	ACROS ORGANICS	226310010	Nucleotides additive.
100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Genes expression induction.
2 M Sucrose	J.T. Baker	1933078	Generating a density gradient.
2 M Glucose	Sigma	16301	Generating a density gradient.
H2O UltraPure Water (UPW)	Bio-Lab	2321777500	DNase & RNase free
S30-T7 lysate	_	_	Prepared at step 1.                                                                        Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage.
Stock of DNA plasmid of choice	_	_	Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor
D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation)
Floor incubator shaker or Thermomixer	MRC	TOU-120-2	Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
	PHMT Grant Bio	PSC18	Thermomixer
Centrifuge	Thermo Scientific	75004270	(75003629) – TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C.
Table centrifuge	Thermo Scientific	75002420	(75003424) – 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C.
Vortex mixer	Scientific industries	SI-0256
Crushed ice bucket	Bel-Art	M18848-4001
2 mL screw neck glass vials	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232
Sterile 15 mL plastic tubes	Thermo Scientific	339651
Sterilized 1.5 mL plastic tubes	Eppendorf	30120086
Sterilized pipette tips	Corning		Sterilized by autoclave.