Hücre Serbest Bakteriyel Özler, Lipozomlar ve Emülsiyon Transferi Kullanarak Protein Üreten Sentetik Hücreler Hazırlama
Summary
Bu protokol, RNA ve protein üreten sentetik hücrelerin aşağıdan yukarıya hazırlanması için yöntem, malzeme, ekipman ve adımları açıklamaktadır. Sentetik hücrelerin iç sulu bölmesi bir lipid bilayer içinde kapsüllenmiş S30 bakteriyel lizat içeriyordu (yani, istikrarlı lipozomlar), bir su-in-oil emülsiyon transferi yöntemi kullanarak.
Abstract
Sentetik hücrelerin yapımı için aşağıdan yukarıya montaj yaklaşımı, hücre taklit ortamında hücresel süreçleri izole etmek ve araştırmak için etkili bir araçtır. Ayrıca hücresiz ifade sistemlerinin geliştirilmesi, protein üretimini, transkripsiyon ve çeviri süreçlerini (DNA→RNA→protein) kontrollü bir şekilde yeniden oluşturma yeteneğini ortaya çıkararak sentetik biyolojiden yararlanmıştır. Burada güçlü bir bakteriyel lizat üretimi ve bu lizatiçinde kolesterol açısından zengin lipid bazlı unilamellar veziküller içinde kapsülleme dahil olmak üzere bir hücre serbest ifade sistemi hazırlamak için bir protokol tarif (GUVs) (yani, istikrarlı lipozomlar), sentetik hücreler oluşturmak için. Protokol, aktif bakteriyel lizatların üretimi de dahil olmak üzere sentetik hücrelerin bileşenlerinin hazırlanmasına yönelik yöntemleri açıklar ken, ardından sentetik hücrelerin petrol de-yağ da emülsiyon transfer yöntemine dayalı olarak adım adım hazırlanmasını sağlar. Bunlar, farklı protein türleri üretmek için yüksek çok yönlülük ile basit ve uygun fiyatlı bir şekilde sentetik hücrelerin milyonlarca üretimini kolaylaştırmak. Elde edilen sentetik hücreler izole bir ortamda protein/RNA üretimini ve aktivitesini araştırmak, yönlendirilmiş evrim de ve aynı zamanda vücutta ki terapötik proteinlerin isteğe bağlı üretimi için kontrollü bir ilaç dağıtım platformu olarak kullanılabilir.
Introduction
Sentetik hücreler yapay hücre benzeri parçacıklar, bir canlı hücrenin bir veya birden fazla fonksiyonlarını taklit, bölme yeteneği gibi, membran etkileşimleri oluşturmak, ve genetik kod1dayalı proteinleri sentezlemek1 ,2,3. Hücre içermeyen protein sentezi (CFPS) sistemlerini içine alan sentetik hücreler, DNA şablonundaki değişikliklerden sonra çeşitli proteinler ve RNA dizileri üretme yetenekleri nedeniyle yüksek modülerliğe sahiptir. Protein üretiminin mevcut yaklaşımlarına cazip bir alternatif sunan CFPS sistemleri hücre lisat, saflaştırılmış bileşenler veya sentetik bileşenlere dayanır ve ribozomlar, RNA polimeraz, amino asitler ve enerji kaynakları (örn. 3 fosfogliserin ve adenin trifosfosfat)4,,5,6,7,8,9gibi protein sentezi için gerekli tüm transkripsiyon ve çeviri makinelerini içerir. Lipid veziküller içinde bir CFPS sisteminin kapsülleme canlı hücre 10 bağlı olmadan proteinlerin basit ve verimli üretim sağlar10. Ayrıca, bu platform doğal hücreler içinde bozulabilir peptidlerin sentezi sağlar, canlı hücreler için toksik proteinlerin üretimi, ve doğal olmayan amino asitler ile proteinleri değiştirmek11,12. Sentetik hücreler, hücresel yaşamı evrimsel bir perspektiften etkinleştirmek için gerekli olan minimal hücre bileşenlerini araştırmak için bir model olarak kullanılmıştır1,13. Sentetik hücreler de oluşturmak ve genetik devre uygulamak için kullanılan ve yönettiği evrim için modeller olarak14,15,16. Diğer çalışmalar, sentetik hücrelerin doğal hücrelerin biyolojik aktivitesini taklit etme yeteneği üzerinde durarak, diyabetli hastalarda beta hücreleri gibi hasarlı doğal hücrelerin yerini almayı hedeflemektedir17. Ayrıca, bu CFPS kapsülleme sentetik hücreleri çeşitli terapötik proteinler üretmek için yeteneği klinik kullanıma dahil olma potansiyelini göstermektedir18.
Burada, lipid vezikül içinde kapsüllenmiş bir CFPS sistemine dayalı RNA ve protein üreten sentetik hücrelerin üretimi için aşağıdan yukarıya laboratuvar ölçekli bir protokol(Şekil 1)açıklıyoruz. Bu in vivo19terapötik bir protein ilacıyerinde üretimi için yeni ilaç dağıtım sistemleri olarak sentetik hücre platformlarının potansiyel kullanımını gösterir. Önceki çalışmalarda CFPS reaksiyonunun optimizasyonu ve hücre lysat ekibe hazırlık süreçleriaraştırılmıştır 4,8,20. Ayrıca, mikroakışkan ve polimer bazlı damlacık stabilizasyon yöntemleri21,22,23gibi hücre büyüklüğünde lipozom preparat için çeşitli teknikler uygulanmıştır, ayrıca lipozomların lipid bileşimi24,,25,26. Sunulan protokolde sentetik hücreler yağ da su emülsiyon transfer yöntemi kullanılarak üretilir ve kapsülleme işlemi düşük sıcaklıklarda (<4 °C)5,10,24,27,28olarak gerçekleştirilir. Bu hafif koşullar moleküler makine biyo-fonksiyonel bütünlüğünü korumak için olumlu olduğu bulunmuştur, yani ribozomlar ve proteinler27,29,30. Partiküllerin lipid bileşimi hem kolesterol hem de 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (POPC) oluşur. İlk tüm memeli hücre zarlarında bulunan ve membran istikrar, sertlik ve geçirgenlik azaltma için gerekli olan, ve ikinci memeli fosfolipid bileşimi taklit11,13. Hücresel transkripsiyon ve çeviri moleküler makine CFPS potens ve protein sentezini artırmak için pAR1219 plazmid overexpressing T7 RNA polimeraz ile dönüştürülür BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli) suşu elde edilir. Bu sistem tanısal ve terapötik proteinler üretmek için kullanılmıştır, kadar moleküler ağırlıkları ile 66 kDa in vitro ve in vivo19,31. Aşağıdaki protokol, doğada protein sentezi ile ilişkili çok çeşitli temel sorulara cevap verebilen ve uyuşturucu dağıtım uygulamalarında da kullanılabilen sentetik hücre sisteminin üretimi için basit ve etkili bir yöntem sunmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, büyük miktarlarda protein üreten sentetik hücrelerin üretimi için basit ve uygun fiyatlı bir yöntem tanıetmektedir. Etkin hücrelerin verimi, birkaç kritik adıma vurgu ile protokolün dikkatli ve doğru uygulanmasına bağlıdır. Bu yöntemin lizate hazırlama bölümünde, bakteri lizate proteinlerin yeterli miktarda elde etmek için hücre lizis önce uygun bakteri yoğunluğuulaşmak esastır. İkinci olarak, lysis işlemi 4 °C’de yapılmalı ve protein aktivitesini korumak için sıvı nitro…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma ERC-STG-2015-680242 tarafından desteklenmiştir.
Yazarlar ayrıca Technion Entegre Kanser Merkezi (TICC) desteğini kabul; Russell Berrie Nanoteknoloji Enstitüsü; Kamyon I. Lokey Disiplinlerarası Yaşam Bilimleri ve Mühendislik Merkezi; Kamin Hibesi için İsrail Ekonomi Bakanlığı (52752); İsrail Bilim Teknoloji ve Uzay Bakanlığı – Baş Bilim Adamı Ofisi (3-11878); İsrail Bilim Vakfı (1778/13, 1421/17); İsrail Kanser Derneği (2015-0116); GIF Young hibesi için Alman-İsrail Bilimsel Araştırma ve Geliştirme Vakfı (I-2328-1139.10/2012); Avrupa Birliği FP-7 IRG Kariyer Entegrasyonu Hibeprogramı (908049); Fosfolipid Araştırma Merkezi Hibe; Bir Rosenblatt Kanser Araştırmaları Vakfı, Mallat Aile Vakfı Hibe; ve Unger Aile Vakfı. A. Schroeder Alon ve Taub Bursları’nı kabul ediyor. O. Adir, Sherman ve Gutwirth burslarını kabul eder. G. Chen, Sherman Bursu’nu kabul ediyor. N. Krinsky, Rothschild Caesarea Vakfı’nın Barones Ariane de Rothschild Kadın Doktora Programı’nı kabul eder.
Materials
| A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation) | |||
| E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
| pAR1219 | Sigma | T2076 | TargeTron vector for transformation. |
| Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | Stored at -20 °C. |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate. |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 15 g/L Agar agar purified | Merck | 1.01614.5007 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL). |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 12 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L). |
| 24 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 4% (v/v) Glycerol anhydrous | Bio-Lab | 7120501 | |
| 2.32 g/L K2HPO4 | Spectrum chemical | P1383 | |
| 12.54 g/L KH2PO4 | Spectrum chemical | P1380 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT) | TCI | D1071 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| 10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 | Sigma | T1503 | S30 lysate buffer (1.5 L) |
| 14 mM magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | |
| 60 mM potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | |
| 1 mM DTT | TCI | D1071 | |
| 0.5 mL/L 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Equipment required for step 1 | |||
| 100 mL sterilized Erlenmeyer flasks | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 flasks |
| 2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 flasks |
| Floor incubator shaker | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) – Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g. * Pre-cooled to 4 °C. |
| High pressure homogenizer | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | Pre-cooled to 4 °C. |
| -80oC freezer | SO-LOW | U85-18 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Spectrophotometer | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
| 96-well transparent plate | Thermo Scientific | 167008 | |
| Sterilized graduated cylinder | Corning | ||
| Sterilized centrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Sterilized pipette tips | Corning | Preferably pre-cooled to -20 °C. | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| Small liquid nitrogen tank | NALGENE | 4150-4000 | |
| B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation): | |||
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | Powder |
| Cholesterol | Sigma | C8667 | Powder |
| Chloroform | Bio-Lab | 3082301 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | Light oil |
| Equipment required for step 2 | |||
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Heating block | TECHNE | FDB03AD | Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature. |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator. |
| 9mm Screw Cap | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
| C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures): | |||
| HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) – pH buffer |
| Potassium hydroxide (KOH) | Frutarom | 55290 | |
| 1 M Magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | Co-factor and negative charge stabilizor. |
| 1 M Potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | Negative charge stabilizor. |
| 5.2 M Ammonium acetate | Merck | 1.01116.1000 | Stabilizes negative charge. |
| 50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Increases the concentration of the macromolecules. |
| 0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) | Sigma | P8877 | Secondary energy source. |
| 50 mM Amino acids mixture I | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17 natural amino acids – alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine. |
| 50 mM Amino acids mixture II | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids – tryptophan, phenylalanine, and tyrosine. |
| 100 mM Adenine triphosphate (ATP) | Sigma | A3377 | Nucleotides & energy source. |
| 50 mM Guanidine triphosphate (GTP) | Sigma | G8877 | Nucleotides & energy source. |
| 100 mM Uridine triphosphate (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Nucleotides additive. |
| 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Genes expression induction. |
| 2 M Sucrose | J.T. Baker | 1933078 | Generating a density gradient. |
| 2 M Glucose | Sigma | 16301 | Generating a density gradient. |
| H2O UltraPure Water (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase free |
| S30-T7 lysate | _ | _ | Prepared at step 1. Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. |
| Stock of DNA plasmid of choice | _ | _ | Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor |
| D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation) | |||
| Floor incubator shaker or Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| PHMT Grant Bio | PSC18 | Thermomixer | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) – TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C. |
| Table centrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) – 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C. |
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
| Sterile 15 mL plastic tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Sterilized pipette tips | Corning | Sterilized by autoclave. | |
Riferimenti
- Blain, J. C., Szostak, J. W. Progress toward synthetic cells. Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).
- Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).
- Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
- Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
- Stano, P. Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols. Chemistry-A European Journal. , (2019).
- Lewandowski, B., et al. Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine. Science. 339 (6116), 189-193 (2013).
- Li, J., et al. Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).
- Kim, T. W., et al. An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source. Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).
- Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. From DNA to protein: No living cells required. Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review. Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).
- Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
- Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).
- Arnold, F. H. Design by directed evolution. Accounts of Chemical Research. 31 (3), 125-131 (1998).
- Chen, Z., et al. Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion. Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).
- Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need. Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).
- Krinsky, N., et al. Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors. Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163 (2018).
- Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).
- Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models. Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
- Göpfrich, K., et al. One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells. ACS synthetic biology. , (2019).
- Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578 (2014).
- Periasamy, A., et al. Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs. Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).
- Kalmbach, R., et al. Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes. Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).
- Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
- Rampioni, G., et al. Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa. Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).
- Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. . Biosynthesis of proteins inside liposomes. , 127-145 (2010).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Krinsky, N., et al. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS One. 11 (10), 0165137 (2016).
- Pédelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79 (2006).
- Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).
- Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).
- Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. Journal of Visualized Experiments. , e54278 (2016).
- Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells. Scientific Reports. 7, 45167 (2017).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
