I denne artikel beskriver vi en detaljeret protokol for effektiv modellering af Duchenne muskelsvind muskel ved hjælp af MYOD1-konverteredeurin-afledte celler til at evaluere restaureringen af dystrophin mRNA og protein niveauer efter exon springe.
Duchennemuskeldystrofi (DMD), en progressiv og dødelig muskelsygdom, er forårsaget af mutationer i DMD-genet, der resulterer i fravær af dystrophin protein. Til dato har vi gennemført en investigator-initieret første-i-human undersøgelse på National Center of Neurology and Psychiatry baseret på den systemiske injektion af morpholino oligonukleotider, som er tilbøjelige til exon-53 springe. Til effektiv behandling af DMD anses in vitro-test med myoblaster fra DMD-patienter for at screene lægemidler og vurdere patientens berettigelse, før de kliniske forsøg udføres, for at være afgørende. For ganske nylig rapporterede vi en ny MYOD1-konvertereturin-afledte celle (UDC) behandlet med histon methyltransferase hæmmer (3-deazaneplanocin A hydrochlorid), som en cellulær model af DMD. Den nye autologe UDC kan vise fænokopi af de sygdomsspecifikke fænotyper af DMD, hvilket fører til anvendelse af præcisionsmedicin i en række muskelrelaterede sygdomme. I denne artikel beskriver vi en detaljeret protokol for effektiv modellering af DMD muskelceller ved hjælp af MYOD1-konverteredeUDCs sammen med omvendt transkriptase polymerase kædereaktion (RT-PCR), Vestlige blotting, og immuncytokemi at evaluere restaurering af dystrophin mRNA og protein niveauer efter exon springe.
Duchennes muskeldystrofi (DMD), en progressiv, dødelig muskelsygdom, er forårsaget af frame-shift mutationer i DMD genet, der resulterer i fravær af dystrophin protein1. Antisense oligonukleotid-baserede exon springe terapi menes at være lovende for DMD. Denne behandling er baseret på omdannelsen af severer DMD fænotype til mildere Becker muskelsvind-lignende fænotype ved at ændre pre-mRNA splejsning at genoprette DMD læsning ramme2. Vi har for nylig afsluttet en første-i-human undersøgelse baseret på gentagen intravenøs administration af fosforrodiamidat morfoolino oligomer (PMO) viltolarsen, som kan fremkalde exon 53 springer i DMD, og viste en fremragende sikkerhedsprofil, lovende effekt, og acceptable farmakokinetiske parametre (registreret som UMIN: 000010964 og ClinicalTrials.gov: NCT02081625)3.
Men for at udvikle omkostningseffektive og effektive behandlinger for sygdommen er in vitro-test ved hjælp af primære muskelceller fra DMD-patienter afgørende for lægemiddelscreening og kontrol af patientens berettigelse, før der udføres kliniske forsøg, samt biomarkører, der afspejler effekten af exon-overspringningsbehandlinger under forsøg4på mennesker. For ganske nylig, vi rapporterede en ny teknologi til at udvikle patient-specifikke MYOD1-konverteredeurin-afledte celler7(UDCs)5,,6 som en primær myoblast model af DMD 7 . Således, at generere myoblasts, kun indsamling af urin fra patienter er påkrævet, og ingen invasiv procedure er nødvendig. I denne artikel beskriver vi en detaljeret protokol for effektiv modellering af DMD muskel ved hjælp af MYOD1-konverteredeUDCs behandlet med 3-deazaneplanocin En hydrochlorid til at evaluere den restaurerede dystrophin mRNA og protein efter exon spring.
Her beskriver vi en detaljeret protokol af exon springe i MYOD1-konverteredeUDCs opnået fra DMD patienter. Ved hjælp af analysesystemet screenede vi optimale antisense-sekvenser effektivt. Vi antager, at MYOD1-konverteredeUDCs kan være nyttige for undersøgelsen af sygdomspatofiologi.
Evaluering af exon springer ved hjælp af patient-afledte celler på mRNA-niveau er uundværlig for screening af nye lægemidler og vurdering af patientens berettigelse, før der foretages kliniske forsøg. Beregning af exon springe effektivitet kan kun evalueres på et mRNA-niveau.
Evaluering af exon springe på protein-niveau er også vigtigt, fordi dystrophin restaurering er vigtigt som en surrogat biomarkør til at forudsige fordelene ved exon springe. Til dato, screening af antisense oligonukleotid sekvenser udføres ofte ved hjælp af primære muskel cellelinjer eller udødeliggjort myoblast cellelinjer, herunder menneskelige rhabdomyosarcoma (RD) celler, men vi kan ikke måle inddrivelse n af dystrophin niveauer ved hjælp af muskel cellelinjer eller RD cellelinjer, fordi de udtrykker dette protein endogent. Vi kan tydeligt opdage restaurering af dystrophin i DMD patient-afledt MYOD1-UDCsi en dosis-afhængig måde. I vores nye analyse mener vi, at evalueringen af genoprettet protein ved western blotting er overlegen i kvantificerbarhed. På den anden side, evaluering ved immuncytokemi ved hjælp af 96 godt plader er ideel til screening mange kandidat forbindelser samtidigt.
I denne artikel beskriver vi en detaljeret protokol for en effektiv modellering DMD muskel ved hjælp af MYOD1-konverteredeUDCs sammen med RT-PCR, Western blotting, og immuncytochemistry at evaluere den restaurerede dystrophin på mRNA og protein niveauer efter exon springe. UDCs kan indsamles noninvasively og nemt. Derfor antager vi, at den helt nye in vitro-analyse kan anvendes på en bred vifte af grundlæggende og translationelle undersøgelser uanset typen af muskelforstyrrelser.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Japan Society for the Promotion of Science Grant-in-Aid for Scientific Research (C) [grant no. 18K07544 til Y.A.], Grants-in-Aid for Research on Nervous and Mental Disorders [grant no. 28-6 til Y.A.], og Japan Agency for Medical Research and Development [grant nos. 18ek0109239h0002, 18lm0203066h0001 og 18lm0203069h0001 til Y.A.].
1% P/S Solution Stabilized | Thermo Fisher | 15070-063 | Cell culture |
Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 | |
Anti-dystrophin | Abcam | ab15277 | Western blot (WB) |
Anti-dystrophin | Leica | NCL-DYS1 | Immunocytochemistry(ICC) |
Anti-mouse IgG, Dylight 488 | Vector Laboratories | DK-2488 | ICC |
Anti-α-tubulin | Sigma | T6199 | Western bot and ICC |
BZ-X800 | KEYENCE | BZ-800 | Fluorescent microscope |
CELLBANKER | ZENOAQ | CB011 | Cell stock in liquid nitrogen |
ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | 170-8280J1 | WB |
CloneAmp HiFi PCR premix | Clontech | 639298 | Retroviral production |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | Protein extraction for WB |
E.coli DH5 α Competent Cells | TAKARA | 9057 | |
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE healthcare | RPN2232 | WB |
EGF | Peprotech | AF-100-15 | Cell culture |
Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | ASO transfection |
Extra Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703965 | WB |
EzFastBlot HMW | Atto | AE-1460 | WB |
fibroblast growth factor-basic | Sigma-Aldrich | F0291 | Cell culture |
Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Cell culture |
GP2-293 packaging cells | Clontech | 631458 | Retroviral production |
Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | Cell culture |
High glucose DMEM with GlutaMAX-I | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | Cell culture |
High glucose DMEM without sodium pyruvate | GE Healthcare | SH30022.01 | Cell culture |
HiSpeed Plasmid Purification Kit | QIAGEN | 12643 | Retroviral production |
Histofine Simple Stain MAX PO | NICHIREI BIOSCIENCE INC. | 424151 | WB |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | ICC |
Human PDGF-AB | Peprotech | 100-00AB-10UG | Cell culture |
iBind Flex Solution | Thermo Fisher Scientific | SLF2020 | WB |
iBind Flex Western Device | Thermo Fisher Scientific | SLF2000 | WB (Automated mestern-processing device) |
Immobilon-P Transfer Membrane (PVDF) | MERCK | IPVH304F0 | WB |
In-Fusion HD cloning Kit | Clontech | 639648 | Retroviral production |
ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146 | Cell culture |
MILTEX HV 0.45 μm filter | MERCK | SLHV033RS | Retroviral production |
MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Microchip electrophoresis |
MYOD1 (GFP-tagged) | ORIGENE | RG209108 | Retroviral production |
NanoDrop | Thermo Fisher | ND-ONE-W | Spectrophotometer |
Nonessential amino acids | Thermo Fisher | 11140-050 | Cell culture |
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Clontech | 740986.20 | PCR clean up |
NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels | Invitrogen | EA03785BOX | WB |
NuPAGE Antioxidant | Invitrogen | NP0005 | WB |
NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | WB |
NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen | NP0009 | WB |
NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | WB |
One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit | TAKARA | RR066A | Titer check of retroviral vector |
PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Cell culture |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | WB |
Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003 | Retroviral infection |
pRetroX-TetOne-Puro Vector | Clontech | 634307 | Retroviral vecor |
Puromycin | Clontech | 631305 | Cell culture |
QIAGEN OneStep RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | PCR |
REGM Bullet Kit | Lonza | CC-3190 | Material for growth medium of UDCs |
REGM SingleQuots | Lonza | CC-4127 | Material for primary medium of UDCs |
Retrovirus Titer Set | TAKARA | 6166 | Titer check of retroviral vector |
Retro-X Concentrator | Clontech | 631455 | Retroviral production |
RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | WB |
RNeasy kit | Qiagen | 74104 | RNA extraction for PCR |
Tetracycline-free foetal bovine serum | Clontech | 631106 | Cell culture |
Triton-X | MP Biomedicals | 9002-93-1 | ICC |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | Cell culture |
XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | WB |
Xfect transfection reagent | Clontech | 631317 | Transfection of plasmids into packaging cells |