인간 소변 유래 세포에서 얻은 직접 재프로그래밍 된 Myotube에서 건너 뛰는 Exon

Summary

이 문서에서는, 우리는 EXON 건너뛰기 후에 dystrophin mRNA 및 단백질 수준의 회복을 평가하기 위하여 MYOD1-변환된소변 유래 세포를 사용하여 Duchenne 근이영양증 근육의 능률적인 모델링을 위한 상세한 프로토콜을 기술합니다.

Abstract

Duchenne 근 이영양증 (DMD), 진보적이고 치명적인 근육 질병은, dystrophin 단백질의 부재 귀착되는 DMD 유전자에 있는 돌연변이에 기인합니다. 현재까지, 우리는 엑슨-53 건너뛰기 경향이 있는 모르폴리노 올리고뉴클레오티드의 전신 주입에 근거를 둔 신경학과 정신의학의 국립 센터에서 조사자 개시한 첫번째 인간 적인 연구 결과 완료했습니다. DMD의 효과적인 치료를 위해, 임상 시험을 착수하기 전에 약물을 선별하고 환자 자격을 평가하기 위해 DMD 환자에서 파생 된 근세포로 시험관 내 테스트가 필수적이라고 생각됩니다. 최근, 우리는 DMD의 세포 모델로히 히스톤 메틸 트랜스퍼라제 억제제(3-deazaneplanocin A 염산염)로 처리된 새로운 MYOD1-변환된소변 유래 세포(UDC)를 보고했다. 새로운 자가 UDC는 다양한 근육 관련 질병에 정밀 의학의 적용으로 이어지는 DMD의 질병 특이적 표현형의 표현법을 보여줄 수 있습니다. 이 기사에서는, 우리는 IOD1-변환된UdC와 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR), 웨스턴 블로팅 및 면역세포화학을 사용하여 DMD 근육 세포의 효율적인 모델링을 위한 상세한 프로토콜을 설명하여 엑온 건너뛰기 후 디스트로핀 mRNA 및 단백질 수치의 복원을 평가합니다.

Introduction

Duchenne 근 이영양증 (DMD), 진보적인, 치명적인 근육 질병은, dystrophin 단백질의 부재 귀착되는 DMD 유전자에 있는 프레임 교대 돌연변이에 기인합니다^1. 안티센스 올리고뉴클레오티드 기반의 엑온 건너뛰기 요법은 DMD에 유망한 것으로 생각된다. 이러한 치료법은 DMD 판독 프레임^2를복원하기 위해 사전 mRNA 접합을 변경함으로써 더 온화한 베커 근이영양증 과 같은 표현형으로 더 심한 DMD 표현형을 변환하는 것을 기초로 한다. 우리는 최근에 DMD에서 엑톤 53 건너뛰기를 유도할 수 있는 인산아미미아미다테 모르폴리노 올리고머(PMO) viltolarsen의 반복된 정맥 투여에 기초한 최초의 인간 연구를 완료하고, 우수한 안전성 프로파일, 유망한 효능 및 허용 가능한 약동학적 파라미터(UMIN: 000010964및 ClinicalTrials.gov30001064로 등록됨)를 입증했습니다.³

그러나, 질병에 대한 비용 효과적이고 효율적인 치료법을 개발하기 위해, DMD 환자로부터 얻은 1차 근육 세포를 이용한 시험관내 검사는 임상시험을 착수하기 전에 약물 스크리닝 및 환자 자격 검증에 필수적이며, 인체 실험 중 엑슨 스킵 요법의 효능을 반영하는^{바이오마커4.} 최근, 우리는 DMD^7의1 차적인 근세포 모형으로 환자 특정 MYOD1-변환한소변 유래 세포 (UDCs)^5,,6를 개발하기 위하여 새로운 기술을 보고했습니다. 따라서 근세포체를 생성하기 위해서는 환자에게서 소변을 수집할 필요가 있으며 침습적 절차가 필요하지 않습니다. 이 기사에서는, 우리는 MYOD1-변환된DDC를 사용하여 DMD 근육의 효율적인 모델링을 위한 상세한 프로토콜을 설명하며, 엑온 건너뛰기 후 복원된 디스트로핀 mRNA 및 단백질을 평가하기 위해 염산염염을 3-deazaneplanocin A염산염염으로 처리하였다.

Protocol

신경과 정신의학의 국립 센터의 윤리위원회는이 연구를 승인 (승인 ID: A2017-018, A2018-029). 모든 개인은 소변을 제공하기 전에 정보에 입각한 동의를 했다. 모든 실험은 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다. 1. UdC의 격리 및 기본 문화 참고: DDC는 이전에 게시된 프로토콜8,,9,,10에 따라 일부 수정으로 격리되었습니다. 멸균 된 플라스틱 병에 자발적인 유동 동안 소변 샘플을 수집합니다.참고 : 외부 요도 오리피스의 살균은 필요하지 않습니다. 미드스트림 소변은 바이러스 오염의 위험을 줄이는 것이 바람직하다. 다음 절차 전에 재고 시간이 >1 시간인 경우, 소변 샘플은 세포 생존력을 보존하기 위해 4 °C로 옮겨져야 한다. 그러나 불용성 침전제가 나타날 수 있으므로 <4 °C의 온도는 피해야 합니다. 실온에서 10 분 동안 400 x g에서 전체 소변 샘플을 원심 분리합니다. 상한을 흡인하여 튜브에 1 mL을 남깁니다. 소변의 나머지 1 mL에 개별적으로 펠릿을 다시 중단하고 단일 50 mL 튜브에 수집. 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS 99 mL, 페니실린/스트렙토마이신(P/S), 0.5 μg/mL 암포테리신 B, 원심분리기로 구성된 10 mL의 세척 버퍼를 실온에서 10분 동안 200 x g으로 추가합니다. 상한을 흡인하여 튜브에 0.2 mL를 남깁니다. 고혈당 덜베코의 변형된 이글 배지(DMEM)를 1:1 혼합물로 구성된 1.5 mL의 1차 배지에서 세포 펠릿을 재조합인간 표피 성장 인자(EGF), 인슐린, 하이드로 코르티손, 피네프린, T3, 트랜스 페이트랜스린, 10 % 테트라 사이클린이없는 태아 소 혈청 (FBS), 1 % P / S, 0.5 μg / mL 암포테리신 B. 젤라틴 코팅 된 6 개의 웰 플레이트의 3 개의 우물에서 세포를 시드합니다 (각 우물의 총 부피, 1.5 mL). 배양은 24시간 동안 37°C 및 5%CO2에서 가습하였다. 다음 3 일 동안 매일 기본 매체의 1.5 mL를 추가하십시오. 4일째에, 재조합 인간 EGF로 보충된 성장 배지의 1.5 mL로 배지를 대체하고, 인슐린, 하이드로 코르티손, 에피네프린, T3, 트랜스 페이트랜스린, 15% 테트라사이클린 프리 FBS, 0.5% L-알라닌-L-글루타민, 0.5% 비필수 아미노산, 2.5 ng/mL 섬유아세포 성장 인자 기본 (bFGF), 재조합 인간 혈소판 유래 성장 인자 (PGF), 격일로 성장 매체를 변경합니다.참고: UDC 콜로니는 1주일 이내에 나타납니다. UDC 배양이 80-90% 동시성이 되면, PBS로 배지와 세척 세포를 제거하고, 0.25% 트립신-EDTA를 사용하여 모든 세포를 분할하고 3,000-5,000세포/cm2에서 씨앗을 새로운 젤라틴 코팅 60 mm 접시(passage 1)에.참고: UdCs는 액체 질소에 보관할 수 있습니다. UdC는 일반적으로 60mm 배양 접시에서 60-70 % 동률로 3 개의 스톡 튜브로 나뉩니다. 2. 레트로 바이러스 구조 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 MYOD1(NM_002478.4) 플라스미드의 코딩 영역을 증폭시다.참고: 열 사이클러에 대한 MYOD1 증폭 및 조건에 대한 혼합물은 각각 표 1 및 표 2에나타내고 있다. 증폭된 PCR 생성물의 1 μL을 사용하여 약 1,000 bp 크기의 단일 대역을 0.7% agarose 겔 전기동동을 검출하여 MYOD1 서열이 성공적으로 증폭되는지 확인한다. 청소 키트를 사용하여 PCR 제품을 청소하고 분광광도계로 농도를 결정합니다. 표 3에 도시된 바와 같이 혼합물을 37°C에서 하룻밤 동안 테트온 시스템 및 푸로마이신 내성 유전자를 다중 클로닝 부위에서 효소 표적 화된 영역으로 소화한다. 소화된 생성물의 1 μL을 사용하여 0.7% 아가로즈 겔 전기동동아에 의해 단일 밴드를 검출하여 레트로바이러스 벡터가 성공적으로 소화되었다는 것을 확인하였다. 정화 키트를 사용하여 소화 된 제품을 청소하고 분광광도계에 의해 농도를 결정합니다. 증폭된 MYOD1 단편(단계 2.1-2.3에 의해 생성됨)을 소화된 레트로바이러스 벡터(단계 2.4-2.6에 의해 생성됨)로 복제하기 위해, 인융합 클로닝 반응을 수행한다. 표 4에나타낸 바와 같이 반응을 설정하고, 50°C에서 15분 동안 반응을 배양한 다음, 얼음 위에 놓는다. 제조업체의 지침(재료 표)에따라 대장균 유능한 세포를 사용하여 변형을 수행하십시오. 10 g/L 바토 트립톤, 5 g/L 바토 효모 추출물, 5 g/L NaCl, 15 g/L 바토 한천, 50 mg/L 암피실린으로 구성된 LB 배양 판에 배양하여 형질전환된 유능한 세포를 선택합니다. 37°C에서 200 rpm에서 박토 한천 없이 LB 배양 배지에서 선택된 콜로니 및 배양을 하룻밤 동안 픽업한다. 플라스미드 정제키트(표재료)를 사용하여 MYOD1-삽입된레트로바이러스 벡터를 정화하고 분광광도계를 사용하여 정량화한다. 삽입된 MYOD1 서열을 통해 양측에 각각 표적화된 전진 및 후진 프라이머에 의해 증폭된 PCR 제품의 직접 시퀀싱에 의해 MYOD1이 레트로바이러스 벡터에 올바르게 삽입되었는지 확인한다.참고: MYOD1 서열은 융합 복제가 성공할 때 레트로바이러스 벡터 서열 사이에 끼어 있는 것을 검출할 수 있다. 레트로바이러스 생산을 위해, 10cm 콜라겐 코팅 플레이트에 50,000세포/cm2에서 포장 세포를 시드하고 DMEM에서 배양하여 10% FBS를 37°C에서 가습하고 24시간 동안 5%CO2를 가습하였다. 패키징 세포가 80% 동률로 증식할 때, MYOD1-삽입된레트로바이러스 벡터30 μg, 30 μg의 포장 벡터 및 세포 침투 펩타이드를 함유하는 형질감염 시약(표오브 머티리얼)을와류에 의해 10분 동안 배양한다. 배양된 혼합물을 37°C 및 5%CO2에서가습한 포장 세포 및 배양배지에 첨가한다.참고 : 콜라겐 코팅이 필요합니다. 패키징 세포가 배양 플레이트로부터 용이하게 분리되기 때문에 파종 후 24시간 이상에서 형질감염이 더 좋을 수 있다. 4 시간 또는 하룻밤 후, 신선한 성장 매체로 매체를 변경합니다. 바이러스 상류를 수집하고 24 및 48 시간 에서 신선한 매체로 교체하고 상류를 결합합니다. 바이러스 상류를 농축하려면 농축기 시약과 혼합하여 밤새 37 °C에서 배양한 다음 4 °C에서 45 분 동안 1,500 x g에서 원심 분리합니다. 0.45 μm 기공으로 PVDF 필터를 통해 레트로 바이러스 상급자를 걸. 제조업체의 지침에 따라 정량적 PCR 키트 및 열 사이클러 시스템을 사용하여 레트로 바이러스 벡터의 역가를 확인하십시오. 바이러스 상급을 작은 알리쿼트로 나누고 -80 °C에서 비축하십시오. 3. UDCs에서 MYOD1-레트로 바이러스 벡터감염 젤라틴 코팅 60mm 접시에 3,000-5,000 세포 / cm2에서 UdC를 씨앗. 24 시간 의 파종 후, 8 μg / mL의 농도에서 헥사디메트린 브로마이드를 첨가하여 200의 감염의 복합성에서 해동 된 레트로 바이러스 (단계 2.21)를 감염시. 37°C 및 5%CO2에서24시간 배양한 후, MYOD1-트랜스듀싱세포를 선택하기 위해 1 μg/mL 퓨로마이신을 함유하는 신선한 성장 배지로 배양 배지를 대체한다. 격일로 매체를 변경합니다.참고 : MYOD1-양성 세포를 선택할 때, 1 μg / mL puromycin은 일반적으로 선택에 사용됩니다. 적절한 용량을 결정해야합니다. 전광혈이 함유된 플레이트를 사용하고 3-5일 만에 모든 세포를 죽이는 복용량을 선택하십시오. MYOD1-양성 세포는 푸로 마이신을 첨가 한 후 7-10 일 이내에 선택해야합니다. MYOD1-트랜스듀시 드우드Ic는 액체 질소에 저장될 수 있습니다. 4. MYOD1-트랜스듀싱 된 UdCs의 균질 분화 3-데자네 플라노신 A 염산염 (DZNep) 참고: 최근에는 히스톤 메틸트랜스퍼라제 억제제인 DZNep가 후기 근육 조절 요인 중 하나인 MYOGENIN의발현을 현저하게 촉진하고 myotube 분화7을유도할 수 있다고 보고되었습니다. 플레이트 MYOD1-3.5 x 104 세포 /cm2의밀도로 콜라겐 코팅 웰에서 DDC를 변환. 배양은 37°C 및 5%CO2에서가습된다. 24 시간 후, L-알라닌-L-글루타민, 5% 말 혈청, ITS 보충, 1 μg/mL 독시사이클린, 5 μM DZNep로 구성된 고포도당 DMEM으로 구성된 성장 배지를 분화 배지로 변경합니다.참고: 10 mM DZNep 용액은 3개월 동안 -80°C에서 보관할 수 있습니다. 해동 냉동고를 사용하고 반복되는 동결 해동 주기를 피하십시오. 독시사이클린과 DZNep에 의해 활성화된 MYOD1은 모두 증식을 억제하고 UdC의 근생 분화를 촉진한다. 따라서, 독시 사이클린과 DZNep는 myogenic 분화의 유도 후에 추가되는 것이 좋습니다. DZNep는 투여량 의존적 방식으로 MYOD1-UDCs의근생 분화를 촉진한다. 한편, 고농도에서 세포독성을 나타낸다. 따라서, 균질성 분화 및 세포 생체 이용률에 미치는 영향에 따라 1-10 μM에 이르는 DZNep의 적절한 농도를 결정한다. 3일 후, DZNep 없이 분화 배지를 신선한 분화 매체로 변경한다. 그런 다음 3 일마다 매체를 변경합니다.참고: UDC는 서로 융합하고 분화 후 1-2주 이내에 myotube를 형성합니다. 5. MYOD1에서건너 뛰는 엑슨 -변환 된 UdCs 참고: 여기서, 3개의 프로토콜은 환자 유래 세포에서 엑온 건너뛰기를 평가하기 위해 기술된다: 1) 역사체 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)의 디스트로핀 mRNA; 2) 웨스턴 블롯에 의한 복원된 디스트로핀 단백질 신호의 반정질화; 및 3) 면역 세포 화학에 의한 복원 된 디스트로핀 형광 신호의 반정질화. 모든 방법은 용량 의존적 방식으로 엑슨 건너 뛰는 것을 검출 할 수 있습니다. RT-PCR에 의한 엑온 건너뛰기 효율성 평가 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)를 MYOD1-변환된UdCs를 분화 후 7일째에 DMD 환자로부터 수득한 DDC를 트랜스펙트하기 위해, 혼합 ASO, 형질감염 시약(표의 물질)및 분화 배지를 최종 농도로 1-10 μM. 배양가 37°C 및 5%CO2로가습하였다. ASO로 72시간 배양한 후, ASO 없이 배지를 신선한 분화 매체로 바꾼다. ASO 변형 후 3-7 일에서 분화 매체를 제거하고 PBS로 1x를 씻으하십시오. 세포 용해 완충액을 추가하고 UDC를 용해시키고 RNA 추출 키트를 사용하여 전체 RNA를 수확합니다. 분광광도계로 RNA 농도를 측정합니다. 표 5에따라 PCR 튜브에서 1 단계 RT-PCR 반응에 필요한 시약을 결합합니다. 혼합물과 함께 PCR 튜브를 열자전거에 놓습니다. 표 6에따라 열자전거를 실행합니다. 마이크로칩 전기 영동을 수행하고 아래와 같이 어금니 농도를 사용하여 엑온 건너뛰기 효율을 계산합니다.Exon 건너뛰기 효율 (%) = 건너뛴 밴드 / (건너뛴 밴드 + 건너 뛴 밴드) x 100참고: PCR 제품을 단기 보관을 위해 4°C 또는 장기 보관을 위해 -20°C의 냉장고에 보관하십시오. 서양 블로팅에 의해 건너 뛰는 엑소 후 디스트로핀의 검출 5.1.1 단계 및 5.1.2 단계에 따라 ASO 및 배양 MYOD1-UdCs를 트랜스펙트합니다. 3일마다 매체를 변경합니다. 분화 2주 후, 프로테아제 억제제가 함유된 방사성 면역침전 분석(RIPA) 완충액을 사용하여 배양된 세포로부터 총 단백질을 추출한다. 4 °C에서 15 분 동안 14,000 x g에서 얼음과 원심 분리기에 용해를 초음파 처리하십시오. 상급체를 수집하고 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 결정합니다. 0.5 mL 튜브에 총 단백질 15 μg를 추가하고 프로테아제 억제제가 함유된 RIPA 버퍼를 총 부피 10 μL에 첨가하여 희석합니다. 표 7에나타낸 바와 같이 샘플 버퍼, 환원제 및 탈이온수를 추가한다. 세포가 70 °C에서 10 분 동안 용해됩니다. 8.95 g/L 트리신, 6.06 g/L 트리스 베이스, 1.0 g/L 나트륨 도데실 황산염(SDS)을 함유한 트리스 아세테이트 러닝 버퍼를 준비합니다. 샘플(20 μL)을 트리스 아세테이트 3−8% 겔에 적재하고 75분 동안 150V에서 전기 영동을 수행합니다. 메탄올없이 블로팅 버퍼를 준비합니다. PVDF 멤브레인을 메탄올에 20초 간 담근 다음 블롯 버퍼에 넣고 사용 후(최소 10분) 담그십시오. 미니 젤을 사용하여 PVDF 멤브레인을 6 x 8cm 크기로 자르고 미디 젤을 사용하여 8 x 12cm로 자른다. 블로팅 용지를 PVDF 멤브레인의 크기와 동일한 크기로 자르고 사용할 때까지 블로팅 버퍼에 담그십시오. 전기 동동 후, PVDF 멤브레인의 것과 동일한 크기로 겔을 자르고 증류수에 겔을 담급니다. 블로팅 페이퍼, PVDF 멤브레인 및 겔을 반건조 전달 장치에 놓습니다(그림1). 4 mA/cm2에서 30분 동안 옮김을 드시면 됩니다. 증류수로 멤브레인을 2x 헹구어 내보소서. 1차 항체로서 항디스트로핀(1:500) 및 항α-tubulin(1:1,200) 항체를 준비한다. HRP-이컨쥬게이트 항마우스 항체(1:100)를 이차 항체로서 준비한다. 1 차 항체로 막을 배양하고 세척 버퍼로 씻은 다음 실온에서 자동화 된 서양 처리 장치(재료 표)를사용하여 이차 항체로 배양하십시오.참고: 항α-tubulin 항체는 일반적으로 로딩 제어로 사용된다. 1:500 항-디스트로핀 및 1:1,200 항α-tubulin 항체를 포함하는 혼합된 1차 항체 용액은 항체 반응이 동시에 수행될 때 잘 작동한다. 멤브레인을 증류수로 헹구어 보시킵니다. 화학 발광 검출 시약 및 전하 결합 장치(CCD) 카메라 기반 이미저를 사용하여 단백질을 검출합니다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. 면역 세포 화학에 의해 건너 뛰는 엑소 후 디스트로핀의 검출 4.1-4.3 단계에 따라 콜라겐 코팅 된 96 웰 플레이트에서 Myotube에 UdC를 직접 다시 프로그래밍하십시오. 5.1.2 단계 및 5.1.3 단계에 따라 ASO 및 배양 MYOD1-UdCs를 트랜스펙트합니다. 분화 2 주 후, PBS로 세포를 세척하고 4 °C에서 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드에 고정합니다. 0.1% MYOD1요오닉 세제에 0.1% nonionic 세제를 실온에서 10분 동안 투과하고 37°C에서 15분 동안 10% 염소 혈청을 가진 세제를 차단합니다. 4°C에서 1차 항체로 밤새 세포를 배양한다. PBS로 세포를 세척하고 실온에서 30 분 동안 이차 항체로 인큐베이션하십시오.참고: 여기서, 마우스 항-디스트로핀(1:30)은 1차 항체로서 사용되고, 항마우스 IgG는 이차 항체로서 사용되고, Hoechst(1:10,000)는 핵 염색에 사용된다. 형광 현미경을 사용하여 플레이트를 이미지화하고 분석기를 사용하여 동일한 조건하에서 모든 우물에서 형광 신호를 자동으로 반정화합니다.

Representative Results

우리는 UdCs를 쉽고 비침습적으로 수집 할 수 있습니다. DDC는 1차 세포 배양을 시작한 후 1주일 이내에 콜로니를 형성하여 현저한 증식 능력을 관찰했습니다. UDC의 배양은 간단하고, 절차가 정확하게 수행될 때 세균성 또는 곰팡이 오염은 드물었습니다. 도 2는 1차 배양 후 1주일 후 UDC 콜로니의 대표적인 위상 대조 이미지를나타낸다(그림 2A)및 MYOD1-UDCs는분화 후 일주일 후에(그림2B). 도 3은 RT-PCR에 의해 DMD 환자로부터 수득된 UdCs에서 엑온 스킵의 성공적인 검출을 나타낸다. 도3A는 DMD 유전자에서 엑시온 45-54 결실을 가진 6세 남성으로부터 유래된 DZNep 처리 MYOD1-UDC에서안티센스 올리고뉴클레오티드 처리 후 디스트로핀의 RT-PCR 분석을 나타낸다. 오픈 판독 프레임은 exon 44 건너뛰기로 복원되었습니다. 분화 후 14일째, 우리는 용량 의존적 방식으로 건너뛰는 엑슨의 유도를 확인하였다(도3B). 상부 대역은 네이티브 제품을 나타내고, 하부 밴드는 오픈 리딩 프레임을 복원 한 exon 44 건너 뛴 제품을 나타냅니다. 도 4는 투여의존적 방식으로 서양 블로팅에 의해 DMD 환자로부터 수득된 UDC에서 엑손 건너뛰기 후 디스트로핀의 성공적인 검출을 나타낸다. 우리는 또한 면역 세포 화학을 사용하여 복원 된 디스트로핀 발현을 검출했다(도 5). 우리는 96 웰 플레이트에 안티 센스 올리고 뉴클레오티드 (ASO) 형질 감염 후 1 주 형광 현미경으로 디스트로핀의 강도를 측정(그림 5A). MYOD1-UDCs를 대조군 ASO로처리한 MYOD1-UDCs에서보다 현저하게 더 높은 형광 신호가 관찰되었다(도5B). 이 결과는 우리의 새로운 분석이 mRNA 및 단백질 수준에서 DMD 환자에게서 얻은 MYOD1-UDCs에서효율적으로 건너뛰는 엑슨을 평가할 수 있다는 것을 건의합니다. 그림 1: 세미드라이 웨스턴 블롯에 대한 이송 스택의 회로도 표현. 블로팅 버퍼에 담근 두 개의 종이를 음극 단자에 놓고 버퍼에 담근 두 개의 종이를 이 위에 적층했습니다. 완충제에 담근 겔을 PVDF 멤브레인 위에 부드럽게 놓았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2: UdC의 대표 이미지입니다. (A)기본 문화 후 일주일 후 DDC의 위상 대비 이미지. 배율 막대 = 200 μm. 인세트: 흰색 사각형에 있는 영역의 확대된 이미지입니다. (B)차별화 후 일주일 에 MYOD1-UDCs의 위상 대비 이미지. 배율 막대 = 50 μm. 이 그림은 타키자와 외7에서수정되었습니다 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 도 3: RT-PCR에 의해 DMD 환자로부터 수득된 소변 유래 세포(UDC)에서 엑슨 건너뛰기의 성공적인 평가. (a)디스트로핀의 RT-PCR 분석은 3-데아자네플라노신 A염산염(DZNep)에서 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리 후 디스트로핀을 분석-처리된 MYOD1-UDCs는45-54의 엑존을 가진 투신근근이영양증(DMD) 환자로부터 유래하였다. DZNep-처리된 MYOD1-UdCs는또한 대조군으로서 1-10 μM 농도에서 대조군 안티센스로 처리하였다. 상부 대역은 판독 프레임에서 벗어난 제품(Ex 45-54 삭제)을 해제했습니다. 하부 밴드는 오픈 리딩 프레임을 복원 엑슨 44 생략 제품 (Ex 44-54 삭제 및 Ex 44 건너 뛰었다)이었다. (B)건너뛰기 효율은 마이크로칩 전기영동 시스템을 사용하여 (엑소44-스킵 된 전사몰)/(네이티브 + 엑온 44-건너뛰은 전사성 [화살표로 표시]))x 100%로 계산하였다. 단방향 ANOVA 다음에 본페로니의 포스트 혹 테스트를 사용하여 건너뛰는 효율성을 비교했습니다(각 그룹에 대해 n = 3, ****P & 0.0001). 데이터는 평균 ± SEM으로 표현됩니다. 이 그림은 타키자와 외7에서수정되었습니다 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4: 서쪽 얼룩에 의하여 DMD 환자에게서 소변 유래 세포 (UDCs)에서 건너뛰는 엑온의 성공적인 평가. (a)DZNep-treated MYOD1-DDC에서디스트로핀에 대한 대표적인 웨스턴 블롯은 엑소온 45-54 를 건너뛰고 난 후 45-54로 삭제된 DMD 환자로부터. 디스트로핀 검출을 위해, 안티 디스트로핀 (C-말단에 대하여)을 사용하였다. (b)α-tubulin 발현으로 정규화된 밴드의 상대적 강도는 단방향 ANOVA를 수행한 후 단방향 ANOVA를 수행하여 환자 유래 세포에서 비교하였고, 그 다음에 본페로니의 포스트 혹 검정(n=3각 그룹, **P < 0.01, ***P < 0.001, HI=건강한 개별)을 수행하였다. 이 그림은 타키자와 외7에서수정되었습니다 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 도 5: 디스트로핀에 대한 면역세포화학의 히트맵은 DZNep-처리된 MYOD1-UdCs에서안티센스 올리고뉴클레오티드 처리 후 엑손 45-54 결실을 가진 DMD 환자로부터 수득하였다. (A)엑슨 45-54의 삭제는 엑온(44)의 엑온 건너뛰기에 기초하여 개방 판독 프레임을 복원하였다. (B)신호 강도를 96 웰 플레이트상에서 안티센스 올리고뉴클레오티드 형질감염 1주 후에 형광 현미경을 사용하여 정량화하였다. 단방향 ANOVA 다음에 본페로니의 포스트 혹 테스트가 비교에 사용되었습니다(각 그룹에 대해 n = 3-4, ****P & 0.0001). 이 그림은 타키자와 외7에서수정되었습니다 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 시약 볼륨 최종 농도 2x PCR 프리믹스 12.5 μL 1x 전달 프라이머 오후 5시 0.2 μM 역프라이머 오후 5시 0.2 μM 템플릿 80 ng 멸균 된 증류수 최대 25 μL 반응당 총 부피 25 μL 표 1: RT-PCR에 의한 MYOD1 증폭을 위한 혼합물. 98 °C 10s 55 °C 10s } 35사이클 72 °C 10s 표 2: MYOD1 증폭을 위한 열 사이클러조건. 시약 볼륨 10x K 버퍼 2 μL 레트로 바이러스 벡터 (500 ng / μL) 2 μL 제한 효소 1 (2−15 U) 1 μL 제한 효소 2 (2−15 U) 1 μL 멸균 된 증류수 14 μL 총 볼륨 20 μL 표 3: 레트로바이러스 벡터를 소화하기 위해 튜브용 혼합물. 시약 볼륨 정제 MYOD1 조각 100 ng 소화 된 레트로 바이러스 벡터 100 ng 5x 효소 프리믹스 4 μL 멸균 된 증류수 최대 20 μL 총 볼륨 20 μL 표 4: 융합 클로닝 반응에 대한 혼합물. 솔루션 부피/반응(μL) 최종 농도 RNase 무료 물 변수 – 1단계 RT-PCR 버퍼 4 1x dNTP 믹스 (각 dNTP의 10 mM 포함) 0.8 각 dNTP의 400 mM 포워드 프라이머 (10 mM) 1.2 0.6 mM 리버스 프라이머 (10 mM) 1.2 0.6 mM 1단계 RT-PCR 효소 믹스 0.8 – RNase 억제제 (선택 사항) 변수 5-10 단위/반응 템플릿 RNA 50-400 ng 총 볼륨 20 표 5: 1단계 RT-PCR의 1회 반응에 필요한 화합물. 1사이클 역전사 약 30분 50 °C 1사이클 초기 PCR 활성화 단계 약 15분 95 °C 1사이클 변성 1분 94 °C 어 닐 링 1분 60 °C 확장 1분 72 °C 1사이클 최종 확장 약 7분 72 °C 개최 ∞ 4 °C 표 6: 1단계 RT-PCR용 열 사이클러 조건. 시약 볼륨 단백질 (15 μg) 10 μL 샘플 버퍼(4x) 5 μL 환원제(10x) 2 μL 탈이온수 3 μL 총 볼륨 20 μL 표 7: 도데실 황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 대한 샘플의 제조(SDS-PAGE).

Discussion

여기서, 우리는 DMD 환자로부터 수득된 MYOD1-변환된UDCs에서 건너뛰는 엑온의 상세한 프로토콜을 기술한다. 분석 시스템을 사용하여 최적의 안티센스 시퀀스를 효율적으로 선별했습니다. 우리는 MYOD1-변환 된 UDC가 질병의 병리생리학의 조사에 유용 할 수 있다고 가정합니다.

mRNA 수준에서 환자 유래 세포를 사용하여 건너뛰는 엑온의 평가는 임상 시험을 착수하기 전에 새로운 약을 검열하고 참을성 있는 적격성을 평가하기 를 위해 필수적입니다. 엑온 스킵 효율의 계산은 mRNA 수준에서만 평가될 수 있다.

디스트로핀 복원이 엑온 스킵의 이점을 예측하는 대리 바이오마커로서 중요하기 때문에 단백질 수준에서 건너뛰는 엑온의 평가도 중요하다. 현재까지, 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열의 스크리닝은 종종 인간 횡문근종(RD) 세포를 포함하는 1차 근육 세포주 또는 불멸의 근세포세포를 사용하여 수행되지만, 근육 세포주 또는 RD 세포주를 사용하여 이 단백질을 내인적으로 발현하기 때문에 디스트로핀 수치의 회복을 측정할 수 없다. 우리는 DMD 환자 유래 MYOD1-UDCs에서투여 의존적 방식으로 디스트로핀의 복원을 명확하게 검출할 수 있다. 우리의 새로운 분석에서, 우리는 서양 블로팅에 의한 복원 된 단백질의 평가가 정량성에서 우수하다고 생각합니다. 한편, 96개의 웰 플레이트를 이용한 면역세포화학에 의한 평가는 많은 후보 화합물을 동시에 스크리닝하는데 이상적이다.

이 문서에서는, 우리는 MYOD1-변환된UdCs와 함께 RT-PCR, 웨스턴 블로팅 및 면역 세포화학을 사용하여 엑슨 건너뛰기 후 mRNA 및 단백질 수준에서 복원된 디스트로핀을 평가하기 위한 효율적인 모델링 DMD 근육에 대한 상세한 프로토콜을 설명합니다. UdCs는 비침습적이고 쉽게 수집할 수 있습니다. 따라서, 우리는 아주 새로운 시험관 내 분석이 근육 장애의 모형에 관계없이 기본적인 및 번역 연구의 넓은 범위에 적용될 수 있다는 것을 가정합니다.

Materials

1% P/S Solution Stabilized	Thermo Fisher	15070-063	Cell culture
Amphotericin B	Sigma Aldrich	A2942
Anti-dystrophin	Abcam	ab15277	Western blot (WB)
Anti-dystrophin	Leica	NCL-DYS1	Immunocytochemistry(ICC)
Anti-mouse IgG, Dylight 488	Vector Laboratories	DK-2488	ICC
Anti-α-tubulin	Sigma	T6199	Western bot and ICC
BZ-X800	KEYENCE	BZ-800	Fluorescent microscope
CELLBANKER	ZENOAQ	CB011	Cell stock in liquid nitrogen
ChemiDoc MP Imaging System	Bio-Rad	170-8280J1	WB
CloneAmp HiFi PCR premix	Clontech	639298	Retroviral production
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693116001	Protein extraction for WB
E.coli DH5 α Competent Cells	TAKARA	9057
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent	GE healthcare	RPN2232	WB
EGF	Peprotech	AF-100-15	Cell culture
Endo-Porter	GeneTools	2922498000	ASO transfection
Extra Thick Blot Filter Paper	Bio-Rad	1703965	WB
EzFastBlot HMW	Atto	AE-1460	WB
fibroblast growth factor-basic	Sigma-Aldrich	F0291	Cell culture
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050-061	Cell culture
GP2-293 packaging cells	Clontech	631458	Retroviral production
Ham's F-12 Nutrient Mix	Thermo Fisher Scientific	11765-054	Cell culture
High glucose DMEM with GlutaMAX-I	Thermo Fisher Scientific	10569-010	Cell culture
High glucose DMEM without sodium pyruvate	GE Healthcare	SH30022.01	Cell culture
HiSpeed Plasmid Purification Kit	QIAGEN	12643	Retroviral production
Histofine Simple Stain MAX PO	NICHIREI BIOSCIENCE INC.	424151	WB
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570	ICC
Human PDGF-AB	Peprotech	100-00AB-10UG	Cell culture
iBind Flex Solution	Thermo Fisher Scientific	SLF2020	WB
iBind Flex Western Device	Thermo Fisher Scientific	SLF2000	WB (Automated mestern-processing device)
Immobilon-P Transfer Membrane (PVDF)	MERCK	IPVH304F0	WB
In-Fusion HD cloning Kit	Clontech	639648	Retroviral production
ITS Liquid Media Supplement	Sigma-Aldrich	I3146	Cell culture
MILTEX HV 0.45 μm filter	MERCK	SLHV033RS	Retroviral production
MultiNA	SHIMADZU	MCE-202	Microchip electrophoresis
MYOD1 (GFP-tagged)	ORIGENE	RG209108	Retroviral production
NanoDrop	Thermo Fisher	ND-ONE-W	Spectrophotometer
Nonessential amino acids	Thermo Fisher	11140-050	Cell culture
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit	Clontech	740986.20	PCR clean up
NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels	Invitrogen	EA03785BOX	WB
NuPAGE Antioxidant	Invitrogen	NP0005	WB
NuPAGE LDS Sample Buffer	Invitrogen	NP0007	WB
NuPAGE Sample Reducing Agent	Invitrogen	NP0009	WB
NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer	Invitrogen	LA0041	WB
One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit	TAKARA	RR066A	Titer check of retroviral vector
PBS	Thermo Fisher Scientific	14190-250	Cell culture
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23227	WB
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Sigma-Aldrich	TR-1003	Retroviral infection
pRetroX-TetOne-Puro Vector	Clontech	634307	Retroviral vecor
Puromycin	Clontech	631305	Cell culture
QIAGEN OneStep RT-PCR Kit	Qiagen	210212	PCR
REGM Bullet Kit	Lonza	CC-3190	Material for growth medium of UDCs
REGM SingleQuots	Lonza	CC-4127	Material for primary medium of UDCs
Retrovirus Titer Set	TAKARA	6166	Titer check of retroviral vector
Retro-X Concentrator	Clontech	631455	Retroviral production
RIPA buffer	Thermo Fisher Scientific	89901	WB
RNeasy kit	Qiagen	74104	RNA extraction for PCR
Tetracycline-free foetal bovine serum	Clontech	631106	Cell culture
Triton-X	MP Biomedicals	9002-93-1	ICC
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco	25300054	Cell culture
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen	EI0001	WB
Xfect transfection reagent	Clontech	631317	Transfection of plasmids into packaging cells