I den här artikeln beskriver vi ett detaljerat protokoll för effektiv modellering av Duchennes muskeldystrofi muskel med MYOD1-konverteradeurin-härledda celler för att utvärdera återställandet av dystrophin mRNA och proteinnivåer efter exon hoppa över.
Duchennes muskeldystrofi (DMD), en progressiv och dödlig muskelsjukdom, orsakas av mutationer i DMD genen som resulterar i avsaknad av dystrophin protein. Hittills har vi avslutat en prövarinitierad första-i-människa studie vid National Center of Neurology and Psychiatry baserat på systemisk injektion av morpholino oligonukleotider som är benägna att exon-53 hoppa. För effektiv behandling av DMD, in vitro-testning med myoblasts härrör från DMD patienter att screena läkemedel och bedöma patientens behörighet innan de genomför kliniska prövningar tros vara viktigt. Alldeles nyligen rapporterade vi en ny MYOD1-konverteradeurin-härledda cell (UDC) behandlas med histon metyltransferashämmare (3-deazaneplanocin En hydroklorid), som en cellulär modell av DMD. Den nya autologa UDC kan visa fenocopy av sjukdomsspecifika fenotyper av DMD, vilket leder till tillämpning av precision medicin i en mängd olika muskel-relaterade sjukdomar. I den här artikeln beskriver vi ett detaljerat protokoll för effektiv modellering av DMD muskelceller med MYOD1-konverteradeUDCs tillsammans med omvänd transkriptas polymeras kedjereaktion (RT-PCR), västra blotting och immunocytochemistry att utvärdera återställandet av dystrophin mRNA och proteinnivåer efter exon hoppa över.
Duchennes muskeldystrofi (DMD), en progressiv, dödlig muskelsjukdom, orsakas av ram-shift mutationer i DMD genen som resulterar i avsaknad av dystrophin protein1. Antisense oligonukleotid-baserade exon hoppa terapi tros vara lovande för DMD. Denna behandling är baserad på omvandlingen av den severer DMD fenotyp till mildare Becker muskeldystrofi-liknande fenotyp genom att ändra pre-mRNA splitsning för att återställa DMD behandlingen ram2. Vi har nyligen avslutat en första-på-människa studie baserad på upprepad intravenös administrering av fosphorodiamidate morpholino oligomer (PMO) viltolarsen, som kan framkalla exon 53 hoppa i DMD, och visat en utmärkt säkerhetsprofil, lovande effekt, och godtagbara farmakokinetiska parametrar (registrerad som UMIN: 000010964 och ClinicalTrials.gov: NCT02081625)3.
För att utveckla kostnadseffektiva och effektiva behandlingar för sjukdomen är dock in vitro-tester med primära muskelceller som erhållits från DMD-patienter nödvändiga för läkemedelsscreening och kontroll av patientens behörighet innan kliniska prövningar genomförs, samt biomarkörer som återspeglar effekten av exon hoppa över terapier under mänskliga prövningar4. Alldeles nyligen rapporterade vi en ny teknik för att utveckla patientspecifika MYOD1-konverteradeurin-härledda celler (UDCs)5,6 som en primär myoblast modell av DMD7. Således, för att generera myoblasterna krävs endast insamling av urin från patienter och inget invasivt förfarande behövs. I den här artikeln beskriver vi ett detaljerat protokoll för effektiv modellering av DMD muskel med MYOD1-konverteradeUDCs behandlas med 3-deazaneplanocin En hydroklorid att utvärdera återställda dystrophin mRNA och protein efter exon hoppa.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll av exon hoppa i MYOD1-konverteradeUDCs erhållits från DMD patienter. Med hjälp av analyssystemet, screenade vi optimala antisense sekvenser effektivt. Vi antar att MYOD1-konverteradeUDCs kan vara användbart för undersökning av patofysiologiska av sjukdomen.
Utvärdering av exon hoppa med hjälp av patient-härledda celler på mRNA-nivå är oumbärlig för screening nya läkemedel och bedöma patientens behörighet innan de genomför kliniska prövningar. Beräkning av exon hoppa effektivitet kan endast utvärderas på en mRNA-nivå.
Utvärdering av exon hoppa på proteinnivå är också viktigt eftersom dystrofier restaurering är viktigt som ett surrogat biomarkör att förutsäga fördelarna med exon hoppa. Hittills är screening av antisense oligonukleotid sekvenser utförs ofta med primära muskel cellinjer eller förevigade myoblast cellinjer inklusive mänskliga rhabdomyosarcoma (RD) celler, men vi kan inte mäta återvinning av dystrofinnivåer med hjälp av muskel cellinjer eller RD cellinjer eftersom de uttrycker detta protein endogent. Vi kan tydligt upptäcka återställandet av dystrofi i DMD patient-härledda MYOD1-UDCspå ett dosberoende sätt. I vår nya analys anser vi att utvärderingen av restaurerat protein genom västerländsk blotting är överlägsen i kvantifierbarhet. Å andra sidan, utvärdering av immunocytochemistry med 96 väl plattor är idealisk för screening många kandidat föreningar samtidigt.
I den här artikeln beskriver vi ett detaljerat protokoll för en effektiv modellering DMD muskel med MYOD1-konverteradeUDCs tillsammans med RT-PCR, västra blotting och immunocytochemistry att utvärdera återställda dystrophin på mRNA och proteinnivåer efter exon hoppa. UDCs kan samlas in noninvasively och lätt. Därför antar vi att den helt nya in vitro-analysen kan tillämpas på ett brett spektrum av grundläggande och translationella studier oavsett vilken typ av muskelsjukdomar.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Japan Society for the Promotion of Science Grant-in-Aid for Scientific Research (C) [anslag nr 18K07544 till Y.A.], Bidrag till forskning om nervösa och psykiska störningar [bidrag nr. 28-6 till Y.A.], och Japan Agency for Medical Research and Development [anslag nr 18ek0109239h0002, 18lm0203066h0001 och 18lm0203069h0001 till Y.A.].
1% P/S Solution Stabilized | Thermo Fisher | 15070-063 | Cell culture |
Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 | |
Anti-dystrophin | Abcam | ab15277 | Western blot (WB) |
Anti-dystrophin | Leica | NCL-DYS1 | Immunocytochemistry(ICC) |
Anti-mouse IgG, Dylight 488 | Vector Laboratories | DK-2488 | ICC |
Anti-α-tubulin | Sigma | T6199 | Western bot and ICC |
BZ-X800 | KEYENCE | BZ-800 | Fluorescent microscope |
CELLBANKER | ZENOAQ | CB011 | Cell stock in liquid nitrogen |
ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | 170-8280J1 | WB |
CloneAmp HiFi PCR premix | Clontech | 639298 | Retroviral production |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | Protein extraction for WB |
E.coli DH5 α Competent Cells | TAKARA | 9057 | |
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE healthcare | RPN2232 | WB |
EGF | Peprotech | AF-100-15 | Cell culture |
Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | ASO transfection |
Extra Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703965 | WB |
EzFastBlot HMW | Atto | AE-1460 | WB |
fibroblast growth factor-basic | Sigma-Aldrich | F0291 | Cell culture |
Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Cell culture |
GP2-293 packaging cells | Clontech | 631458 | Retroviral production |
Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | Cell culture |
High glucose DMEM with GlutaMAX-I | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | Cell culture |
High glucose DMEM without sodium pyruvate | GE Healthcare | SH30022.01 | Cell culture |
HiSpeed Plasmid Purification Kit | QIAGEN | 12643 | Retroviral production |
Histofine Simple Stain MAX PO | NICHIREI BIOSCIENCE INC. | 424151 | WB |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | ICC |
Human PDGF-AB | Peprotech | 100-00AB-10UG | Cell culture |
iBind Flex Solution | Thermo Fisher Scientific | SLF2020 | WB |
iBind Flex Western Device | Thermo Fisher Scientific | SLF2000 | WB (Automated mestern-processing device) |
Immobilon-P Transfer Membrane (PVDF) | MERCK | IPVH304F0 | WB |
In-Fusion HD cloning Kit | Clontech | 639648 | Retroviral production |
ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146 | Cell culture |
MILTEX HV 0.45 μm filter | MERCK | SLHV033RS | Retroviral production |
MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Microchip electrophoresis |
MYOD1 (GFP-tagged) | ORIGENE | RG209108 | Retroviral production |
NanoDrop | Thermo Fisher | ND-ONE-W | Spectrophotometer |
Nonessential amino acids | Thermo Fisher | 11140-050 | Cell culture |
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Clontech | 740986.20 | PCR clean up |
NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels | Invitrogen | EA03785BOX | WB |
NuPAGE Antioxidant | Invitrogen | NP0005 | WB |
NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | WB |
NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen | NP0009 | WB |
NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | WB |
One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit | TAKARA | RR066A | Titer check of retroviral vector |
PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Cell culture |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | WB |
Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003 | Retroviral infection |
pRetroX-TetOne-Puro Vector | Clontech | 634307 | Retroviral vecor |
Puromycin | Clontech | 631305 | Cell culture |
QIAGEN OneStep RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | PCR |
REGM Bullet Kit | Lonza | CC-3190 | Material for growth medium of UDCs |
REGM SingleQuots | Lonza | CC-4127 | Material for primary medium of UDCs |
Retrovirus Titer Set | TAKARA | 6166 | Titer check of retroviral vector |
Retro-X Concentrator | Clontech | 631455 | Retroviral production |
RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | WB |
RNeasy kit | Qiagen | 74104 | RNA extraction for PCR |
Tetracycline-free foetal bovine serum | Clontech | 631106 | Cell culture |
Triton-X | MP Biomedicals | 9002-93-1 | ICC |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | Cell culture |
XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | WB |
Xfect transfection reagent | Clontech | 631317 | Transfection of plasmids into packaging cells |