Syntese af funktionaliserede magnetiske nanopartikler, deres bøjning med Siderophore Feroxamin og dens evaluering for bakterier detection

Summary

Dette arbejde beskriver protokoller for fremstilling af magnetiske nanopartikler, dens belægning med SiO₂, efterfulgt af dens amine funktionalisering med (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) og dens bøjning med deferoxamin ved hjælp af en succinyl moiety som linker. En dyb strukturel karakterisering beskrivelse og en fange bakterier assay ved hjælp af Y. enterocolitica for alle de mellemliggende nanopartikler og den endelige konjugat er også beskrevet i detaljer.

Abstract

I dette arbejde, syntesen af magnetiske nanopartikler, dens belægning med SiO₂, efterfulgt af dens amine funktionalisering med (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) og dens konjugation med deferoxamin, en siderophore anerkendt af Yersinia enterocolitica, ved hjælp af en succinyl moiety som en linker er beskrevet.

Magnetitens magnetiske nanopartikler (MNP) (Fe₃O₄) blev fremstillet ved solvotermisk metode og belagt med SiO₂ (MNP@SiO₂) ved hjælp af Stöber-processen efterfulgt af funktionalisering med APTES (MNP@SiO₂@NH₂). Derefter blev feroxamin konjugeret med MNP@SiO₂@NH₂ ved carbodiimidekobling for at give MNP@SiO₂@NH₂@Fa. Konjugattens og mellemprodukternes morfologi og egenskaber blev undersøgt ved hjælp af otte forskellige metoder, herunder pulver røntgendiffraktion (XRD), Fourier transform infrarød spektroskopi (FT-IR), Raman-spektroskopi, røntgenfotoelektroskopi (XPS), transmissionseleklektronmikroskopi (TEM) og kortlægning af energispredning X-Ray (EDX). Denne udtømmende karakteristik bekræftede dannelsen af konjugatet. Endelig, for at vurdere kapaciteten og specificiteten af nanopartikler, de blev testet i en fange bakterier assay ved hjælp af Yersinia enterocolitica.

Introduction

De bakteriedetektionsmetoder, der anvender MNP, er baseret på molekylær genkendelse af antistoffer, aptamere, bioprotein, kulhydrater, der er konjugeret til MNP af de patogene bakterier¹. I betragtning af at siderophores er anerkendt af specifikke receptorer på den ydre membran af bakterier, de kunne også knyttet til MNP at øge deres specificitet². Siderophores er små organiske molekyler involveret i Fe^{3 +} optagelse af bakterier^3,4. Udarbejdelsen af konjugater mellem siderophores og MNP sammen med deres vurdering for opsamling og isolering af bakterier er endnu ikke blevet rapporteret.

Et af de afgørende trin i syntesen af konjugater af magnetiske nanopartikler med små molekyler er valget af typen af binding eller interaktion mellem dem for at sikre, at det lille molekyle er fastgjort til overfladen af MNP. Af denne grund, proceduren for at forberede konjugat mellem magnetiske nanopartikler og feroxamin-den siderophore anerkendt af Yersinia enterocolitica-var fokuseret på generering af en modificerbar overflade af MNP at tillade forbinder det kovalent til siderophore af carbodiimide kemi. For at få en ensartet magnetit nanopartikler (MNP) og for at forbedre nukleation og størrelse kontrol, en solvolyse reaktion med benzylalkohol blev gennemført i en termisk blok uden at ryste⁵. Derefter blev en silica belægning genereret af Stöber metode til at give beskyttelse og forbedre stabiliteten af nanopartikler suspension i vandige medier⁶. Under hensyntagen til feroxaminens struktur er det nødvendigt at indføre amingrupper for at producere egnede nanopartikler (MNP@SiO₂@NH₂), der skal konjugeres med den siderophore. Dette blev opnået ved kondensation af (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) med de alkoholgrupper, der var til stede på overfladen af de silica modificerede nanopartikler (MNP@SiO₂) ved hjælp af en sol-gel metode⁷.

Parallelt hermed blev feroxaminjern(III)-komplekset fremstillet ved kompleksdannelse af det kommercielt tilgængelige deferoxamin med jernacetylacetont i vandig opløsning. N-succinylferoxamin, der bærer succinyl grupper, der vil fungere som linkere, blev opnået ved reaktionen af feroxamin med kortfattet anhydrid.

Konjugationen mellem MNP@SiO₂@NH₂ og N-succinylferoxamin for at give MNP@SiO₂@NH_@Fa blev udført gennem carbodiimidekemi ved hjælp af som koblingsreagenser benzotriazol-1-yl-yloxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphat (BOP) og 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) i et blødt grundlæggende medie til aktivering af terminalsyregruppen i N-succinylferoxamin⁸.

Når parlamentarikere blev karakteriseret, vi evalueret mulighederne i nøgne og funktionaliserede magnetiske nanopartikler til at fange vilde type (WC-A) og en mutant af Y. enterocolitica mangler feroxamin receptor FoxA (FoxA WC-A 12-8). Plain parlamentsmedlemmer, funktionaliserede parlamentsmedlemmer og konjugat MNP@SiO₂@NH_@Fa fik lov til at interagere med hver Y. enterocolitica stamme. De bakteriekonjugataggregater blev adskilt fra bakteriesuspensionen ved anvendelse af et magnetfelt. De separerede aggregater blev skyllet to gange med fosfatbufferet saltvand (PBS), re-suspenderet i PBS for at forberede serielle fortyndinger og derefter, de blev belagt til koloni tælling. Denne protokol viser hvert trin i syntesen af MNP@SiO₂@NH@Fa, den strukturelle karakterisering af alle mellemprodukter og konjugat, og en bakterie fange assay som en nem måde at vurdere specificiteten af konjugat i forhold til mellemprodukter. ^kr.

Protocol

BEMÆRK: For de reaktioner, der blev udført under inert atmosfæreforhold, blev alt glasvarer tidligere tørret i en ovn ved 65 °C, forseglet med en gummiskille og renset med argon tre gange. 1. Syntese af magnetiske nanopartikler konjugeret med feroxamin Syntese af Fe3O4 magnetiske nanopartikler (MNPs) Der tilsættes 0,5 g Fe(acac)3 i et 20 ml glashætteglas, og der blandes derefter med 10 ml benzylalkohol. Soniker denne blanding…

Representative Results

En udtømmende strukturel karakterisering udføres for at bestemme morfologien og egenskaberne af hvert mellemprodukt og den endelige konjugat. Til dette formål anvendes teknikkerne XRD, FT-IR, Raman spektroskopi, TGA, TEM, EDX mapping og XPS til at påvise konjugattens dannelse. Oxidationstilstande af atomer på overfladen af nanopartikler erhvervet af X-ray fotoelektroskopi (XPS) er de mest relevante data til at bekræfte dannelsen af kovalente bindinger mellem nanopartikel og siderophore. I overensstemmelse med disse…

Discussion

Denne protokol beskriver syntesen af en konjugat mellem magnetiske nanopartikler og siderophore feroxamin ved kovalent binding. Syntesen af magnetit blev udført ved hjælp af den protokol, der er rapporteret af Pinna et al.⁵ efterfulgt af silicabelægning for at beskytte den magnetiske kerne af korrosion i vandige systemer, for at minimere aggregering og for at give en passende overflade til funktionalisering⁶. Silicabelægningsprocessen blev ændret. I stedet for at udfø…

Materials

1-Hydroxybenzotriazole hydrate HOBT	Acros	300561000
2,2′-Bipyridyl	Sigma Aldrich	D216305
3-Aminopropyltriethoxysilane 99%	Acros	151081000
Ammonium hydroxide solution 28% NH3	Sigma Aldrich	338818
Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent	Acros	209800050
Benzyl alcohol	Sigma Aldrich	822259
Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC)	Sigma Aldrich	D9533
Ethanol, anhydrous, 96%	Panreac	131085
Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical
Iron(III) acetylacetonate 97%	Sigma Aldrich	F300
LB Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022
N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal	Acros	459591000
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal	Acros	326871000
Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal	Acros	339421000
Sephadex LH-20	Sigma Aldrich	LH20100
Succinic anhydride >99%	Sigma Aldrich	239690
Tetraethyl orthosolicate >99,0%	Sigma Aldrich	86578