إنشاء الدائرة المغلقة في الموقع perfusion من أعضاء البطن السفلي وأطراف هند في الفئران
Summary
يوصف بروتوكول للضخ الموضعي للجسم السفلي للماوس ، بما في ذلك المثانة والبروستاتا والأعضاء الجنسية والعظام والعضلات وبشرة القدم.
Abstract
السابقين فيف الكبد هو أداة فسيولوجية هامة لدراسة وظيفة الأجهزة المعزولة (مثل الكبد والكلى). في الوقت نفسه ، بسبب صغر حجم أعضاء الماوس ، فإن قذف الجسم الحي السابق للعظام والمثانة والجلد والبروستاتا والأعضاء التناسلية أمر صعب أو غير مجد. هنا، ونحن تقرير لأول مرة في الموقع دائرة التسريب الجسم السفلي في الفئران التي تشمل الأنسجة المذكورة أعلاه، ولكن يتجاوز أعضاء إزالة الرئيسية (الكلى والكبد والطحال). يتم تأسيس الدائرة عن طريق تعلية الشريان الأورطي البطني و الوريد السفلي فوق الشريان الحرقفي والوريد وتكوية الأوعية الدموية الطرفية. يتم تنفيذ perfusion عن طريق مضخة م peristaltic مع تدفق perfusate الحفاظ على لمدة تصل إلى 2 ساعة. في الموقع تلوين مع الليكتين الفلورسنت وحل Hoechst أكد أن microvasculature تم بنجاح. يمكن أن يكون هذا النموذج الماوس أداة مفيدة جدا لدراسة العمليات المرضية، فضلا عن آليات تسليم المخدرات، والهجرة / الانبثاث من الخلايا السرطانية تعميم داخل / من الورم، وتفاعلات الجهاز المناعي مع الأجهزة والأنسجة المحصنة.
Introduction
تم تطوير إفراز الأعضاء المعزول في الأصل لدراسة فسيولوجيا الأعضاء1،2،3، ومكّن من فهم وظائف الأعضاء دون تدخل من أنظمة الجسم الأخرى. على سبيل المثال ، كان قلب الكلى والقلب المعزول مفيدًا للغاية في فهم المبادئ الأساسية للديناميكا الدموية وآثار العوامل النشطة ، في حين أن ضخ الكبد كان مهمًا لفهم وظيفة التمثيل الغذائي ، بما في ذلك استقلاب الدواء في الأنسجة الصحيةوالمريضة 4،5،6،7. وبالإضافة إلى ذلك، كانت دراسات التسريب حاسمة في فهم جدوى ووظيفة الأعضاء المعدة للزراعة. في أبحاث السرطان، وقد وصفت القذف الورم معزولة من قبل عدة مجموعات باستخدام الفأرة, الفئران, والأنسجة البشرية الطازجة8,9. في بعض البويضات الورم المعزولة ، تم زرع الورم في وسادة الدهون المبيضة لفرض نمو الورم الذي يزود الأوعية الدموية من الشريان الميكرونري10. قامت مجموعة جاين بإجراء دراسات رائدة باستخدام الضخ المعزول من سرطان القولون لفهم ديناميات الدم والتشائلالورم 8,11,12,13. وتشمل غيرها من الاجهزة الهندسة الهندسية السابقة vivo 96-well لوحة المستندة إلى جهاز القذف لثقافة الإنسان الأساسي خلايا المايلوما المتعددة14 وغرفة تدفق وحدات لهندسة نخاع العظام الهندسة والبحوث وظيفة15.
بالإضافة إلى علم وظائف الأعضاء والدراسات علم الأمراض، وقد استخدمت فيرف الجهاز لدراسة المبادئ الأساسية لتسليم المخدرات. وهكذا، وصفت إحدى المجموعات نزف أطراف الفئران المعزولة ودرست تراكم الليبوسومات في الساركوما المزروعة16، في حين قامت مجموعة أخرى بتشريح ضخ الكلى البشري لدراسة الاستهداف البطانية للجسيمات النانوية17. Ternullo وآخرون تستخدم معزولة رفرف الجلد البشري الم perfused باعتبارها قريبة في الجسم الحي الجلد المخدرات الإختراق نموذج18.
وعلى الرغم من هذه التطورات في تخبط الأعضاء والأنسجة الكبيرة، لم تكن هناك تقارير عن نماذج التسريب في الموقع في الفئران التي: أ) تجاوز أعضاء إزالة مثل الكبد والطحال والكلى; ب) تشمل أعضاء الحوض والجلد والعضلات والأعضاء التناسلية (في الذكور) والمثانة والبروستاتا ونخاع العظام. نظرا لصغر حجم هذه الأجهزة وتوريد الأوعية الدموية، السابقين فيتبل vivo وإنشاء دائرة القذف لم يكن ممكنا. الماوس هو النموذج الحيواني الأكثر أهمية في أبحاث السرطان وعلم المناعة، وتسليم الأدوية. القدرة على اغراء أجهزة الماوس الصغيرة من شأنه أن يسمح أسئلة مثيرة للاهتمام بشأن تسليم المخدرات لهذه الأجهزة، بما في ذلك للأورام المزروعة في الحوض (المثانة، البروستاتا، المبيض، نخاع العظام)، إلى أن تتم الإجابة، فضلا عن دراسات علم وظائف الأعضاء الأساسية والمناعة من أمراض هذه الأجهزة. لمعالجة هذا النقص، طورنا دائرة التسريب في الموقع في الفئران التي يمكن أن تجنب إصابة الأنسجة، وأكثر ملاءمة للبحوث الوظيفية من الضخ العضو المعزول.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويمكن استخدام الدائرة الموصوفة للتحقيق في مختلف المسائل البحثية، على سبيل المثال دور مكونات المصل المختلفة وحواجز الأنسجة في تسليم المخدرات، أو الاتجار بالخلايا الجذعية والمناعة. يمكن إضافة أنظمة مختلفة لتوصيل الأدوية (مثل الدهون والجسيمات النانوية) إلى الغشاء من أجل فهم دور العوامل ال…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت الدراسة من قبل منحة المعاهد القومية للصحة CA194058 لDS، سكاغز مدرسة الصيدلة ADR برنامج المنح البذور (DS)؛ المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (منحة رقم 31771093)، مشروع التعاون الدولي لمقاطعة جيلين (No.201180414085GH)، صناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية، برنامج فريق البحوث المبتكرة للعلوم والتكنولوجيا JLU (2017TD-27، 2019TD-36).
Materials
| Equipment | |||
| 3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light | Amscope | SKU: SM-3BZ-80S | |
| Carbon dioxide, USP | Airgas healthcare | 19087-5283 | |
| Confocal microscope | NIKON | ECLIPSE Ti2 | |
| Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp | FIAB | F7244 | |
| Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733692 | Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion |
| Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733524 | keep the chamber's temperature |
| Moist chamber with metal tube heat exchanger | Harvard Apparatus | 732901 | Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature |
| Olsen-Hegar needle holders with suture cutters | Fine Science Tools (FST) | 125014 | |
| Oxygen compressed, USP | Airgas healthcare | C2649150AE06 | |
| Roller pump (part 4 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 730113 | deliver perfusate to cannula in the moist chamber |
| SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 732806 | control the purfusion speed |
| Silicone pad | Harvard Apparatus | ||
| Silicone tubing set (arrows in Figure 1) | Harvard Apparatus (TYGON) | 733456 | |
| Student standard pattern forceps | Fine Science Tools (FST) | 91100-12 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14001-14 | |
| Table for moist chamber | Harvard Apparatus | 734198 | |
| Thermocirculator (part 2 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 724927 | circulating water bath for all water-jacketed components |
| Three-way stopcock (part 5 in Figure 1) | Cole-Palmer | 30600-02 | |
| Veterinary anesthesia machine | Highland | HME109 | |
| Materials | |||
| 19-G BD PrecisionGlide needle | BD | 305186 | For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone |
| 4-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427411 | |
| 6-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427401 | |
| Filter (0.2 µm) | ThermoFisher | 42225-CA | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Permanent marker | Staedtler | 342-9 | |
| Syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-823-2E | |
| Syringe (60 mL) | BD | 309653 | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Reagents | |||
| 1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5) | Sigma | 314-13-6 | |
| 10% buffered formalin | velleyvet | 36692 | |
| BALB/c mice ( 8-10 weeks old ) | Charles River | ||
| Baxter Viaflex lactate Ringer's solution | EMRN Medical Supplies Inc. | JB2324 | |
| Bovine serum albumin | Thermo Fisher | 11021-037 | |
| Cyanoacrylate glue | Krazy Glue | ||
| DyLight-649-lectin | Vector Laboratories,Inc. | ZB1214 | |
| Ethanol (70% (vol/vol)) | Pharmco | 111000190 | |
| Hoechst33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | 66794-017-25 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 |
Riferimenti
- Ghaidan, H., et al. Ten year follow-up of lung transplantations using initially rejected donor lungs after reconditioning using ex vivo lung perfusion. Journal of Cardiothoracic Surgery. 14 (1), 125 (2019).
- Kabagambe, S. K., et al. Combined Ex vivo Hypothermic and Normothermic Perfusion for Assessment of High-risk Deceased Donor Human Kidneys for Transplantation. Transplantation. 103 (2), 392-400 (2019).
- Knaak, J. M., et al. Technique of subnormothermic ex vivo liver perfusion for the storage, assessment, and repair of marginal liver grafts. Journal of Visualized Experiments. (90), e51419 (2014).
- Hems, R., Ross, B. D., Berry, M. N., Krebs, H. A. Gluconeogenesis in the perfused rat liver. Biochemical Journal. 101 (2), 284-292 (1966).
- Nielsen, S., et al. Vasopressin increases water permeability of kidney collecting duct by inducing translocation of aquaporin-CD water channels to plasma membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (4), 1013-1017 (1995).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Schreiter, T., et al. An ex vivo perfusion system emulating in vivo conditions in noncirrhotic and cirrhotic human liver. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 342 (3), 730-741 (2012).
- Sevick, E. M., Jain, R. K. Viscous resistance to blood flow in solid tumors: effect of hematocrit on intratumor blood viscosity. Ricerca sul cancro. 49 (13), 3513-3519 (1989).
- Duyverman, A. M., et al. An isolated tumor perfusion model in mice. Nature Protocols. 7 (4), 749-755 (2012).
- Sears, H. F., et al. Ex vivo perfusion of a tumor-containing colon with monoclonal antibody. J Surg Res. 31 (2), 145-150 (1981).
- Duda, D. G., et al. Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21677-21682 (2010).
- Kristjansen, P. E., Boucher, Y., Jain, R. K. Dexamethasone reduces the interstitial fluid pressure in a human colon adenocarcinoma xenograft. Ricerca sul cancro. 53 (20), 4764-4766 (1993).
- Sevick, E. M., Jain, R. K. Geometric resistance to blood flow in solid tumors perfused ex vivo: effects of tumor size and perfusion pressure. Ricerca sul cancro. 49 (13), 3506-3512 (1989).
- Zhang, W. T., et al. Ex vivo Maintenance of Primary Human Multiple Myeloma Cells through the Optimization of the Osteoblastic Niche. PLoS One. 10 (5), (2015).
- Di Buduo, C. A., et al. Modular flow chamber for engineering bone marrow architecture and function. Biomaterials. 146, 60-71 (2017).
- Lokerse, W. J. M., Eggermont, A. M. M., Grull, H., Koning, G. A. Development and evaluation of an isolated limb infusion model for investigation of drug delivery kinetics to solid tumors by thermosensitive liposomes and hyperthermia. Journal of Controlled Release. 270, 282-289 (2018).
- Tietjen, G. T., et al. Nanoparticle targeting to the endothelium during normothermic machine perfusion of human kidneys. Science Translational Medicine. 9 (418), (2017).
- Ternullo, S., de Weerd, L., Flaten, G. E., Holsaeter, A. M., Skalko-Basnet, N. The isolated perfused human skin flap model: A missing link in skin penetration studies. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 96, 334-341 (2017).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, 4986 (2008).
- Hekman, M. C., et al. Targeted Dual-Modality Imaging in Renal Cell Carcinoma: An Ex vivo Kidney Perfusion Study. Clinical Cancer Research. 22 (18), 4634-4642 (2016).
- Graham, R. A., Brown, T. R., Meyer, R. A. An ex vivo model for the study of tumor metabolism by nuclear magnetic resonance: characterization of the phosphorus-31 spectrum of the isolated perfused Morris hepatoma 7777. Ricerca sul cancro. 51 (3), 841-849 (1991).
