マウスにおける下腹部および後肢の脳閉回路灌流における確立
Summary
プロトコルは、膀胱、前立腺、性器、骨、筋肉および足の皮膚を含むマウス下半身の上皮灌流に記載されている。
Abstract
エクスビボ灌流は、孤立した器官(例えば肝臓、腎臓)の機能を研究するための重要な生理学的ツールである。同時に、マウス器官のサイズが小さいため、骨、膀胱、皮膚、前立腺、生殖器官のエクスビボ灌流は困難であるか、または実現不可能である。ここでは、上記組織を含むマウスの下半身灌流回路を初めて報告するが、主なクリアランス器官(腎臓、肝臓、脾臓)をバイパスする。この回路は、腸骨動脈および静脈の上の腹部大動脈および下大静脈をカニューララットし、末梢血管を焼灼することによって確立される。灌流は、パーフューズン流を最大2時間維持した蠕動ポンプを介して行われる。蛍光レクチンおよびHoechst溶液によるその際の染色では、マイクロバスキュアチュアが正常に浸透していることを確認した。このマウスモデルは、病理学的プロセス、および薬物送達のメカニズム、腫瘍への循環腫瘍細胞の移動/転移、および浸透した器官および組織との免疫系の相互作用を研究するのに非常に有用なツールとなり得る。
Introduction
孤立した臓器灌流は、もともと移植のための臓器生理学を研究するために開発された11、2、3、2,3そして他の身体システムからの干渉なしに器官の機能の理解を可能にした。例えば、単離した腎臓および心臓灌流は、血行力学の基本原理および血管活性剤の効果を理解するのに非常に有用であったが、肝臓灌流は、健康および疾患組織44、5、6、75,6,7における薬物代謝を含む代謝機能を理解する上で重要であった。さらに、移植を目的とした臓器の生存率と機能を理解する上で、灌流研究は重要であった。癌研究では、単離された腫瘍灌流は、マウス、ラット、および新たに切除されたヒト組織88、99を用いていくつかのグループによって説明されている。いくつかの単離された腫瘍灌流では、腫瘍を卵巣脂肪パッドに移植し、腸間動脈10から血管を供給する腫瘍の成長を強制する。Jainグループは、結腸腺癌の単離灌流を用いて、腫瘍血球力学および転移88、11、12、13を理解するための先駆的な研究11,12を行った。他の革新的な工学的なex vivoのセットアップは、主要なヒト多発性骨髄腫細胞14を培養する96ウェルプレートベースの灌流装置および骨髄アーキテクチャおよび機能研究15を工学用のモジュラー流動室を含む。
生理学と病理研究に加えて、臓器灌流は薬物送達の基本原理を研究するために使用されてきた。したがって、1つの群は、単離されたラット四肢灌流を説明し、移植肉腫16におけるリポソームの蓄積を研究し、別の群は解剖されたヒト腎臓灌流を行い、ナノ粒子17の内皮標的化を研究した。Ternulloら. 単離された浸透ヒト皮膚フラップを近い生体内皮膚薬物浸透モデル18として使用した。
大きな臓器や組織の灌流におけるこれらの進歩にもかかわらず、マウスのsitu灌流モデルでは、a)肝臓、脾臓、腎臓などのクリアランス器官をバイパスするという報告はありません。b)骨盤臓器、皮膚、筋肉、生殖器官(男性)、膀胱、前立腺および骨髄が含まれる。これらの器官のサイズが小さく、脈管構造を供給するため、エキソビボカヌラ化および灌流回路の確立は実現不可能であった。マウスは、がんや免疫学の研究、および薬物送達において最も重要な動物モデルです。小さなマウス器官を穿フューズする能力は、骨盤に移植された腫瘍(膀胱、前立腺、卵巣、骨髄)を含むこれらの器官への薬物送達に関する興味深い質問を答えることを可能にし、これらの器官の疾患の基礎生理学および免疫学の研究を可能にする。この欠乏に対処するために、我々は、潜在的に組織損傷を回避することができ、単離された臓器灌流よりも機能的研究にはるかに適しているマウスのsitu灌流回路を開発した。
Protocol
Representative Results
Discussion
記載された回路は、様々な研究問題、例えば薬物送達における異なる血清成分および組織障壁の役割、または免疫および幹細胞の密売を調査するために使用することができる。異なる薬物送達システム(例えば、リポソームおよびナノ粒子)は、送達における生理学的および生化学的要因の役割を理解するためにパーフューザートに添加することができる。灌流の持続時間は、研究された組織?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、DS、スカッグス薬学部ADR種子助成金プログラム(DS)にNIH助成金CA194058によってサポートされました。中国国立自然科学財団(グラント31771093)、吉林省国際協力プロジェクト(No.201180414085GH)、中央大学基礎研究基金、JLU科学技術革新的研究チームプログラム(2017TD-27、2019TD-36)。
Materials
| Equipment | |||
| 3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light | Amscope | SKU: SM-3BZ-80S | |
| Carbon dioxide, USP | Airgas healthcare | 19087-5283 | |
| Confocal microscope | NIKON | ECLIPSE Ti2 | |
| Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp | FIAB | F7244 | |
| Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733692 | Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion |
| Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733524 | keep the chamber's temperature |
| Moist chamber with metal tube heat exchanger | Harvard Apparatus | 732901 | Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature |
| Olsen-Hegar needle holders with suture cutters | Fine Science Tools (FST) | 125014 | |
| Oxygen compressed, USP | Airgas healthcare | C2649150AE06 | |
| Roller pump (part 4 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 730113 | deliver perfusate to cannula in the moist chamber |
| SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 732806 | control the purfusion speed |
| Silicone pad | Harvard Apparatus | ||
| Silicone tubing set (arrows in Figure 1) | Harvard Apparatus (TYGON) | 733456 | |
| Student standard pattern forceps | Fine Science Tools (FST) | 91100-12 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14001-14 | |
| Table for moist chamber | Harvard Apparatus | 734198 | |
| Thermocirculator (part 2 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 724927 | circulating water bath for all water-jacketed components |
| Three-way stopcock (part 5 in Figure 1) | Cole-Palmer | 30600-02 | |
| Veterinary anesthesia machine | Highland | HME109 | |
| Materials | |||
| 19-G BD PrecisionGlide needle | BD | 305186 | For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone |
| 4-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427411 | |
| 6-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427401 | |
| Filter (0.2 µm) | ThermoFisher | 42225-CA | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Permanent marker | Staedtler | 342-9 | |
| Syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-823-2E | |
| Syringe (60 mL) | BD | 309653 | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Reagents | |||
| 1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5) | Sigma | 314-13-6 | |
| 10% buffered formalin | velleyvet | 36692 | |
| BALB/c mice ( 8-10 weeks old ) | Charles River | ||
| Baxter Viaflex lactate Ringer's solution | EMRN Medical Supplies Inc. | JB2324 | |
| Bovine serum albumin | Thermo Fisher | 11021-037 | |
| Cyanoacrylate glue | Krazy Glue | ||
| DyLight-649-lectin | Vector Laboratories,Inc. | ZB1214 | |
| Ethanol (70% (vol/vol)) | Pharmco | 111000190 | |
| Hoechst33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | 66794-017-25 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 |
Riferimenti
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