Märklös genborttagning av Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis i Chlamydia trachomatis
Summary
Beskrivs här är en metod för riktade, markörlösa genborttagning i Chlamydia trachomatis med floxed kassett allelisk utbyte mutagenes, FLAEM.
Abstract
Klamydia trachomatis är en obligate intracellulär patogen som historiskt har varit svårt att genetiskt manipulera. Definitiva framsteg i att belysa de mekanismer som C. trachomatis använder för att skapa och upprätthålla en privilegierad intracellulär nisch har begränsats på grund av brist på genetiska verktyg. Lyckligtvis har det nyligen gjorts flera nya framsteg inom genetisk manipulation stekniker. Bland dessa är utvecklingen av fluorescens-rapporterade allelic utbyte mutagenes (FRAEM). Denna metod möjliggör riktad genborttagning i kombination med införandet av ett urval kassett kodning antibiotikaresistens och grönt fluorescerande protein (GFP). Beroendet av denna strategi kan vara komplicerat när man riktar gener inom polycistroniska operoner på grund av polareffekternas potential på gener i efterföljande led. Floxed kassettallelic utbyte mutagenes (FLAEM), det protokoll som beskrivs här, har utvecklats för att lindra kassett-inducerad polareffekter. FLAEM använder Cre-loxP genomredigering för att ta bort valet kassett efter riktad borttagning av allelic utbyte. De resulterande stammarna innehåller markörlösa genborttagningar av en eller flera kodningssekvenser. Denna teknik underlättar direkt bedömning av genfunktion och utökar repertoar av verktyg för genetisk manipulation i C. traomat.
Introduction
Klamydia trachomatis är den vanligaste orsaken till bakteriell sexuellt överförbara sjukdomar och utgör en betydande börda för människors hälsa. Över 100 miljoner människor är smittade varje år med C. trachomatis1. Cirka 70% av infektionerna hos kvinnor är asymtomatiska trots skadliga reproduktiva hälsoeffekter, såsom bäckeninflammation, utomkvedshavandeskap och/eller infertilitet. Disease sequela är direkt relaterade till immunpatologi initieras av C. trachomatis infektion2. Ett effektivt vaccin har ännu inte utvecklats. Därför är förståelse n hos bakteriellvirulensfaktorer och andra bakteriegenprodukter en viktig och brådskande forskningsfråga.
Som intracellulära bakterier, värdcellinvasion, intracellulär replikering, frisättning av avkomma och undanflykter av värdimmunologiska svar är kritiska processer. C. trasrör bildar ett parasitoforous membran bundet vacuole, kallas en inkludering, för intracellulär utveckling. Upprättandet av inkluderingen och många andra kritiska processer uppnås genom utsöndring av effektellerproteiner via ett sekretsystem av typ III (T3SS)3. Belysa funktionerna hos dessa utsöndrade effektorer var begränsad i många år på grund av den genetiska intractability av C. trasomat. Till skillnad från E. coliär många klassiska kloningstekniker inte tillämpliga på Klamydia. Några stora begränsningar innebär omvandling effektivitet, brist på motval reportrar såsom sacB, och plasmid underhåll. Medan E. coli plasmider i allmänhet kan upprätthållas på obestämd tid med ett ursprung i replikering och lämpligt selektivt tryck, C. traomatis plasmider kräver ytterligare åtta öppna läsramar(pgp1-8) för underhåll som finns på den ursprungliga pL2 plasmid inom L2 serovar4.
Under de senaste åren har det förekommit flera genetiska verktyg som har genererats som rymmer Chlamydia unika biologi, men det finns fortfarande begränsningar5,6,7. Kemisk mutagenes genom etylmetanulfonat (EMS) behandling kan införa missense mutationer, eller (mindre ofta) kan resultera i nukleotid övergångar införa en för tidig stopp kodon att ge en nonsens mutation8. Transposon insättning är effektiv för genstörningar, men nuvarande teknik i Klamydia forskning är mödosam och tidskrävande9. Både EMS behandling och transposon mutagenesis tekniker generera slumpmässiga mutationer och kräver rigorösa screening metoder för att isolera mutanta stammar. En metod för att störa gener genom införande av grupp II-introner (t.ex. TargeTron) möjliggör riktad mutagenes; Denna metod begränsas dock av effektivitet och insättningsplatsen är inte alltid korrekt förutspådd10.
Fluorescensrapporterade allelic utbyte mutagenes (FRAEM) är en strategi som används för riktade genborttagning i kombination med införandet av ett urval kassett som ger antibiotikaresistens och en fluorescens reporter11. Ändå kompliceras FRAEM av risken för kassettinducerade polareffekter på gener i efterföljande led, särskilt när gener inom polycistroniska operoner riktar sig. Floxed kassettallelutbyte (FLAEM) är en ny genetisk metod som utvecklats för att lindra de kassetter-inducerade polareffekter som tidigare observerats med FRAEM urvalkassetten12. FLAEM använder Cre-loxP genomredigering för att ta bort urvalkassetten och återställa uttryck för nedströms gener. Urvalskassetten som innehåller antibiotikaresistens och grönt fluorescerande protein (GFP) omkonstrueras med flankerande loxP-platser. Dessa loxP-platser kan kombineras i närvaro av Cre rekombinas och resultera i excision av kassetten frångenomet 13. Denna strategi har visat sig lindra kassettinducerade polareffekter när man riktar sig till tmeA för radering12,14.
Både FRAEM och FLAEM metoder använder samma självmord vektor, pSUmC 4.0, som kan villkorligt upprätthållas genom inducerbara uttryck för pgp6. Uttryck för pgp6 har tidigare visat sig vara nödvändigt för plasmid retention och är därför utnyttjas för att kontrollera plasmid underhåll11,15. När C. trasomat odlas i media kompletteras med vattenfri tetracyklin (aTc) för att inducera pgp6 uttryck, vektorn upprätthålls. I avsaknad av aTc, är vektorn förlorad. Riktad genborttagning uppnås genom allelic utbyte av genen för valet kassett. De 3 kb regionerna direkt uppströms och nedströms av den riktade genen fungera som homologi armar för rekombination. Dessa armar klonas in i pSUmC 4.0 vektor flankerande valet kassett. Framgångsrika C. trasrör omvandling och recombination händelser observeras genom fluorescens rapportering. Uttryck för mCherry på vektorn stamben och gfp inom valet kassett avkastning röda och gröna fluorescerande inneslutningar. När aTc tas bort från kulturmedia, grön-bara inneslutningar indikeraframgångsrika rekombination händelser med förlusten av självmord vektor och integration av valet kassett i bakteriegenomet.
FLAEM representerar en förlängning av FRAEM via efterföljande omvandling av en Cre rekombinas-uttrycka vektor, pSU-Cre, i den nyskapade mutant stam. Cre rekombinas underlättar rekombination mellan loxP-platser och excision av urvalskassetten. Rekombinationshändelser anges via fluorescensrapportering. PSU-Cre vektor kodar mCherry; således indikeras framgångsrik omvandling genom tillägg av röd fluorescens till gfp-uttryckainkluderingar. Odling i avsaknad av selektivt tryck för kassetten resulterar i kremedierad kombination på loxP-platserna, och förlust av kassetten indikeras av endast röda inkluderingar. Som med pSUmC-4.0 används inducerbart uttryck för pgp6 för att villkorligt upprätthålla pSU-Cre. När aTc och antibiotika urval tas bort, plasmid botas, och den resulterande markörlösa borttagning stam är nonfluorescerande. Den här metoden åtgärdar problemet med kassettinducerade polareffekter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet beskrivs här för generering av markörlösa genborttagningar i C. trachomatis av FLAEM möjliggör riktad borttagning av onödiga gener och eliminerar kassettinducerade polareffekter. Protokollet bygger på noggrann utformning av 5 och 3 homologi armar in i pSUmC 4.0 självmord vektor, effektiv omvandling av C. trakomat, och noggrann screening av isolerade mutantstammar. Framgångsrik genomteknik via denna metod resulterar i bakterier som är nonfluorescent och innehåller en enda loxP…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Public Health Service bidrag från National Institute of Health, NIAID (bidrag A1065530 och Al124649), till KA Fields.
Materials
| Agarose | KSE Scientific | BMK-A1705 | Molecular Biology Grade |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | ACROS Organics | 233131000 | |
| CaCl2 Buffer | 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | C7902-500G | Suitable for cell culture |
| Cycloheximide | Sigma | 7698-1G | |
| dam–/dcm– Competent E. coli | New England BioLabs | C2925H | |
| DMSO | ATCC | 4-X | Sterile filtered cell culture tested |
| Glutamic acid | Sigma | G8415-100G | L-Glutamic acid |
| Growth Media #1 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS). | ||
| Growth Media #2 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide | ||
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) | Gibco | 24020-117 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) | Gibco | A38402-02 | |
| McCoy Cells | ATCC | CRL-1696 | |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England BioLabs | T1010S | Small scale DNA purification |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139-250G | Sodium phosphate monobasic |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136-500G | Sodium phosphate dibasic |
| NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells | New England BioLabs | C3020K | |
| NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5520S | Gibson Assembly Kit |
| Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-10MU | Bioreagent suitable for cell culture |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | Large scale DNA purification |
| Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0515 | Fragment PCR Polymerase |
| RPMI 1640 Medium (1x) | Gibco | 11875-093 | Containing 2mM L-glutamine |
| Sall-HF | New England BioLabs | R3138S | |
| Sbfl-HF | New England BioLabs | R3642S | |
| Selection Media #1 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO | ||
| Selection Media #2 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin | ||
| Selection Media #3 | RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin | ||
| Sodium Acetate Buffer Solution | Sigma | S7899-100ML | 3M |
| SOC Outgrowth Medium | New England BioLabs | B9020SVIAL | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade | Alfa Aesar | J61820 | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1KG | Bioreagent suitable for cell culture |
| Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG) | 37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water | ||
| Tris | AMRESCO | 0497-5KG | Ultrapure grade |
| Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-056 | 0.25% |
| Water | Sigma | W3500-500ML | Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture |
Riferimenti
- World Health Organization. Global Incidence and Prevalence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections: 2008: World Health Organization. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, 207-208 (2012).
- Stephen, R. S. The Cellular Paradigm of Chlamydial Pathogenesis. Trends in Microbiology. 11, 44-51 (2003).
- Mueller, K. E., Plano, G. V., Fields, K. A. New Frontiers in Type III Secretion Biology: the Chlamydia Perspective. Infection and Immunity. 82, 2-9 (2014).
- Seth-Smith, H. M. B., et al. Co-evolution of genomes and plasmids within Chlamydia trachomatis and the emergence in Sweden of a new variant strain. BMC Genomics. 10, 239 (2009).
- Brothwell, J. A., Muramatsu, M. K., Zhong, G., Nelson, D. E. Advances and obstacles in genetic dissection of chlamydial virulence. Current Topics in Microbiology and Immunology. 412, 133-158 (2018).
- McClure, E. E., et al. Engineering of obligate Intracellular bacteria: progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15, 544-558 (2017).
- Rahnama, M., Fields, K. A. Transformation of Chlamydia: current approaches and impact on our understanding of chlamydial infection biology. Microbes and Infection. 20 (7-8), 445-450 (2018).
- Kari, L., et al. Generation of targeted Chlamydia trachomatis null mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7189-7193 (2011).
- LaBrie, S. D., et al. Transposon Mutagenesis in Chlmaydia trachomatis Identifies CT339 as a ComEC Homolog Important for DNA Uptake and Later Gene Transfer. mBio. 10 (4), 01343 (2019).
- Johnson, C. M., Fisher, D. J. Site-specific, insertional inactivation of incA in Chlamydia trachomatis using a group II intron. PLoS One. 8, 83989 (2013).
- Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7, 01817 (2016).
- Keb, G., Hayman, R., Fields, K. A. Floxed cassette Allelic Exchange Mutagenesis Enables Markerless Gene Deletion in Chlamydia trachomatis and can Reverse Cassette-Induced Polar Effects. Journal of Bacteriology. 200, 00479 (2018).
- Yarmolinsky, M., Hoess, R. THe legacy of Nat Sternberg: the genesis of Cre-lox technology. Annual Review of Virology. 2, 25-40 (2015).
- McKuen, M. J., Mueller, K. E., Bae, Y. S., Fields, K. A. Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis Reveals a Role for Chlamydia trachomatis TmeA in Invasion that is Independent of Host AHNAK. Infection and Immunity. 85 (12), 00640 (2017).
- Song, L., et al. Chlamydia trachomatis Plasmid-Encoded Pgp4 is a Transcriptional Regulator of Virulence-Associated Genes. Infection and Immunity. 81 (3), 636-644 (2013).
- Silayeva, O., Barnes, A. C. Gibson Assembly facilitates bacterial allelic exchange mutagenesis. Journal of Microbiological Methods. 144, 157-163 (2017).
- Hackstadt, T., Scidmore, M., Rockey, D. Lipid Metabolism in Chlamydia trachomatis-Infected Cells: Directed Trafficking of Golgi-Derived Sphingolipids to the Chlamydial Inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
- Jeffrey, B. M., Suchland, R. J., Eriksen, S. G., Sandoz, K. M., Rockey, D. D. Genomic and phenotypic characterization of in vitro-generated Chlamydia trachomatis recombinants. BMC Microbiology. 13, 142 (2013).
- Suchland, R. J., Bourillon, A., Denamur, E., Stamm, W. E., Rothstein, D. M. Rifampin-resistant RNA polymerase mutants of Chlamydia trachomatis remain susceptible to the ansamycin rifalazil. Antimicrobial Agents Chemotherapy. 49, 1120-1126 (2005).
