Monitoring van eIF4F-assemblage door eIF4E-eIF4G-interactie in levende cellen te meten
Summary
Hier presenteren we een protocol om eIF4E-eIF4G-interactie in levende cellen te meten waarmee de gebruiker door geneesmiddelen veroorzaakte verstoring van de complexe dynamiek van eIF4F in screeningsformaten kan evalueren.
Abstract
De vorming van het eIF4F-complex is het belangrijkste stroomafwaartse knooppunt gebleken voor de convergentie van signaleringsroutes die vaak oncogene activering bij de mens ondergaan. eIF4F is een cap-binding complex dat betrokken is bij de mRNA-ribosoom wervingsfase van vertaalinitiatie. In veel cellulaire en preklinische modellen van kanker leidt de deregulering van eIF4F tot een verhoogde vertaling van specifieke mRNA-subsets die betrokken zijn bij de proliferatie en overleving van kanker. eIF4F is een hetero-trimerisch complex gebouwd van de cap-bindende subeenheid eIF4E, de helicase eIF4A en de steigersubeenheid eIF4G. Cruciaal voor de assemblage van actieve eIF4F-complexen is de eiwit-eiwitinteractie tussen eIF4E- en eIF4G-eiwitten. In dit artikel beschrijven we een protocol voor het meten van eIF4F-assemblage dat de status van eIF4E-eIF4G-interactie in levende cellen bewaakt. De eIF4e:4G-celgebaseerde eiwit-eiwitinteractietest maakt het ook mogelijk om door geneesmiddelen geïnduceerde veranderingen in de complexe integriteit van eIF4F nauwkeurig en betrouwbaar te beoordelen. We stellen ons voor dat deze methode kan worden toegepast voor het verifiëren van de activiteit van commercieel beschikbare verbindingen of voor verdere screening van nieuwe verbindingen of modaliteiten die de vorming van eIF4F-complex efficiënt verstoren.
Introduction
Controle van genexpressie speelt een cruciale rol bij de juiste uitvoering van cellulaire programma’s zoals groeiproliferatie en differentiatie. Een regelgevend controlemechanisme kan worden uitgeoefend op het niveau van gentranscriptie of op het niveau van mRNA-vertaling. In het laatste decennium is het steeds duidelijker geworden dat translationele controle door modulatie van het initiatieproces in plaats van de latere stappen van verlenging en beëindiging de synthese van specifieke subsets van eiwitten die een breed scala aan biologische functies spelen, fijn kan reguleren.
Verhoogde vertaling van mRNAs die betrokken zijn bij overleving, anti-autofaagische en anti-apoptotische reacties zijn betrokken bij verschillende kankers en zijn ook oorzakelijk gekoppeld aan afwijkende activering of overexpressie van vertaalinitiatiefactoren1.
Het eIF4F-complex is een hoofdregulator voor het initiëren van vertalingen. Door de cap-structuur aan het 5′-uiteinde van mRNAs te binden, drijft eIF4F de initiële mRNA-ribosoomwerving aan en verhoogt het op zijn beurt de mRNA-vertaalefficiëntie van zwak vertaalde eukaryotische mRNAs2. eIF4F-gemedieerde vertaling van kankergerelateerde mRNAs is gemeld voor veel kankermodellen die afwijkende activering van RAS/MAPK- of AKT/TOR-trajecten bevatten, wat suggereert dat kankercellen eIF4F upreguleren om hun eigen pro-neoplastische activiteit te stimuleren. Verstoring van deze feed-forward loop door het remmen van de complexe vorming van eIF4F is daardoor een veelbelovende therapeutische strategie3,4.
Het eIF4F-complex bestaat uit (i) eIF4E, de cap-bindende subeenheid van eIF4F die interageert met de capstructuur van de 5′ UTR van mRNA, (ii) eIF4A, de RNA helicase en (iii) eIF4G, het steigereiwit dat interageert met zowel eIF4A als eIF4E en dat uiteindelijk de 40S ribosomale subeenheid5werft . eIF4G-associatie met eIF4E is de tariefbeperkende stap voor de assemblage van functionele eIF4F-complexen en wordt negatief gereguleerd door de eIF4E-bindende eiwitten (4EBPs, leden 1, 2 en 3))6. Door te concurreren met eIF4G binding aan eIF4E via een interface die bestaat uit canonieke en niet-canonieke eIF4E bindingssequenties7,8,9 (regio met aa 604-646 op menselijke eIF4E), vermindert 4EBP de pool van eIF4E die actief betrokken is bij vertaling en het voorkomen van eIF4F complexe vorming. Het samenspel van deze eiwit-eiwitinteracties wordt voornamelijk gereguleerd door het zoogdierdoel van rapamycine (mTOR)-gemedieerde fosforylering van 4EBP. Bij mitogene stimuli fosforyleert mTOR rechtstreeks de leden van de 4E-BP-eiwitfamilie, vermindert hun associatie met eIF4E en bevordert daardoor de interactie tussen eIF4E en eIF4G en de vorming van functionele eIF4F-complexen10.
Ondanks de grote inspanningen bij het ontwikkelen van verbindingen gericht op eIF4F-complexe integriteit, heeft het gebrek aan assays die directe verstoring van eIF4E-eIF4G-interactie in levende cellen meten, de zoektocht naar cellulaire actieve hitverbindingen beperkt. We hebben een luciferase-test toegepast op basis van een coelenterazine-analoog (bijv. op Nanoluc gebaseerde complementatietest) om de status van eIF4F-integriteit in realtime te controleren via de eIF4E-eIF4G-interactie. Het luciferase complementatie eiwitsysteem bestaat uit een 18 kDa eiwitfragment (SubA) en 11 aminozuur peptide fragment (SubB) geoptimaliseerd voor minimale zelfassociatie en stabiliteit11. Eenmaal uitgedrukt als een fusieproduct met de menselijke full length eIF4E en het eIF4E interactiedomein van menselijke eiF4G1 (aa 604-646), zullen de twee interagerende eiwitten het SubA- en SubB-fragment dicht bij elkaar brengen en de vorming van de actieve luciferase induceren die, in aanwezigheid van een celdoorlatend substraat, uiteindelijk een helder lichtgevend signaal zal genereren (Figuur 1). We hebben elders melding gemaakt van de constructie en validatie van het eIF4E:eIF4G604-646 complementatiesysteem16.
Hier beschrijven we hoe het eIF4E:eIF4G604-646 complementatiesysteem (beschikbaar op aanvraag) kan worden toegepast om 4EBP1-gemedieerde eIF4E-eIF4G-verstoring in levende cellen nauwkeurig te meten. Bovendien tonen we het nut ervan aan door de effecten te meten van verschillende mTOR-remmers die momenteel worden getest als potentiële kankertherapeutische geneesmiddelen12. Omdat off-target effecten vaak drugspecifieke activiteit maskeren, beschrijven we ook hoe de veelzijdigheid van de eIF4E:eIF4G604-646 systeemmeting kan worden uitgebreid met orthogonale metingen van cellulaire levensvatbaarheid om hiermee rekening te houden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De in dit artikel beschreven methode maakt gebruik van een op luciferase gebaseerde complementatietest om de complexe assemblage van eIF4F kwantitatief te monitoren door middel van directe meting van eIF4G-eIF4E-interactie in levende cellen. We hebben details verstrekt voor het gebruik van het eIF4E-eIF4G-complementatiesysteem en we hebben ook laten zien dat het systeem uiterst nauwkeurig is bij het meten van door geneesmiddelen geïnduceerde 4EBP1-gemedieerde dissociatie van eIF4E-eIF4G-interactie16</s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het kernbudget van het p53lab (BMSI, A*STAR) en de JCO VIP-subsidie (A*STAR).
Materials
| 293FT cells | Thermo Fisher Scientific | R70007 | |
| Cell culture microplate 96 well, F-Bottom | greiner bio-one | 655083 | |
| Cell titer Glo 2.0 | PROMEGA | G9241 | |
| Envision Multilabel Reader | PerkinElmer | not applcable | |
| Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662070 | |
| Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662050 | |
| FUGENE6 | PROMEGA | E2692 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | |
| NanoBiT PPI Starter Systems | PROMEGA | N2014 | |
| Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | |
| Orbital shaker | Eppendorf | not appicable | |
| γ-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose | Jena Bioscience | AC-155S |
Riferimenti
- Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular Mechanism of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).
- Bhat, M., et al. Targeting the translation machinery in cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).
- Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development. Ricerca sul cancro. 75 (2), 250-263 (2015).
- Montanaro, L., Pandolfi, P. P. Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E. Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).
- Merrick, W. C. eIF4E: A retrospective. Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).
- Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G. Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).
- Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein. Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).
- Grüner, S., et al. The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation. Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).
- Gingras, A. C., et al. Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1. Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).
- Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Sun, S. Y. mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs. Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Sekiyama, N., et al. Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).
- Muller, D., et al. 4E-BP restrains eIF4E phosphorylation. Translation. 1 (2), e25819 (2013).
- Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly. BMC Biology. (1), 40 (2019).
- Ran, X., Gestwicki, J. E. Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area. Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).
