ניטור הרכבת eIF4F על-ידי מדידת אינטראקציית eIF4E-eIF4G בתאים חיים
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול למדידת אינטראקציה eIF4E-eIF4G בתאים חיים שיאפשר למשתמש להעריך הפרעה הנגרמת על ידי סמים של דינמיקה מורכבת eIF4F בפורמטי סינון.
Abstract
היווצרות של קומפלקס eIF4F הוכח להיות צומת במורד הזרם מפתח להתכנסות של מסלולי איתות כי לעתים קרובות לעבור הפעלה oncogenic בבני אדם. eIF4F הוא קומפלקס מחייב כובע מעורב בשלב גיוס mRNA-ריבוזום של ייזום תרגום. במודלים תאיים ופרה-קליניים רבים של סרטן, הסרת הפיקוח על eIF4F מובילה לתרגום מוגבר של תת-קבוצות mRNA ספציפיות המעורבות בהתפשטות סרטן ובהישרדות. eIF4F הוא קומפלקס הטרו-טרימרי שנבנה מתוך eIF4E subunit מחייב כובע, eIF4A הליקאז ואת eIF4G subunit פיגומים. קריטי להרכבה של קומפלקסים פעילים של eIF4F היא אינטראקציית החלבון-חלבון בין חלבוני eIF4E ו- eIF4G. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול למדידת הרכבה eIF4F המפקח על המצב של אינטראקציה eIF4E-eIF4G בתאים חיים. eIF4e:4G תא מבוסס חלבון חלבון אינטראקציה assay גם מאפשר שינויים המושרה על ידי התרופה בשלמות מורכבת eIF4F להיות מוערך במדויק ואמין. אנו צופים כי שיטה זו יכולה להיות מיושמת לאימות הפעילות של תרכובות זמינות מסחרית או להקרנה נוספת של תרכובות חדשניות או אופנים כי ביעילות לשבש היווצרות של קומפלקס eIF4F.
Introduction
שליטה בביטוי גנים ממלאת תפקיד מרכזי בביצוע נכון של תוכניות תאיות כגון התפשטות צמיחה ובידול. מנגנון בקרה רגולטורי יכול להיות מופעל או ברמה של שעתוק גנים או ברמה של תרגום mRNA. בעשור האחרון, זה הפך להיות יותר ויותר ברור כי שליטה תרגום על ידי אפנון של תהליך החניכה ולא את הצעדים המאוחרים יותר של התארכות וסיום יכול לווסת דק סינתזה של תת קבוצות ספציפיות של חלבונים לשחק מגוון רחב של פונקציות ביולוגיות.
תרגום מוגבר של mRNAs המעורבים בהישרדות, תגובות אנטי אוטופגיות ואנטי אפופטוטיות היו מעורבות במספר סוגי סרטן וגם נקשרו באופן סיבתי להפעלה חריגה או לביטוי של גורמי ייזום תרגום1.
קומפלקס eIF4F הוא וסת ראשי של ייזום תרגום. על ידי איגוד מבנה הכובע בקצה 5 ‘של mRNAs, eIF4F הוא נהיגה גיוס mRNA-ריבוזום הראשונית בתורו הגדלת יעילות תרגום mRNA של mRNAs eukaryotic מתורגם חלש2. eIF4F מתווך תרגום של mRNAs הקשורות לסרטן דווחה עבור מודלים סרטניים רבים מחסה הפעלה חריגה של RAS / MAPK או AKT / TOR מסלולים, מה שמרמז כי תאים סרטניים upregulate eIF4F כדי להגביר את הפעילות שלהם פרו-neoplastic. שיבוש של לולאה זו להאכיל קדימה על ידי עיכוב היווצרות מורכבת eIF4F היא ובכך אסטרטגיה טיפולית מבטיחה מאוד3,4.
קומפלקס eIF4F מורכב (i) eIF4E, יחידת המשנה מחייבת הכובע של eIF4F המקיימת אינטראקציה עם מבנה הכובע שנמצא ב- UTR 5 ‘ של mRNA, (ii) eIF4A, הליקאז RNA ו- (iii) eIF4G, חלבון הפיגום המקיים אינטראקציה הן עם eIF4A והן עם eIF4E ואשר בסופו של דבר מגייס את תת-יחידת ה- 40S ריבוזומלית5. eIF4G שיוך עם eIF4E הוא צעד הגבלת קצב להרכבה של קומפלקסים eIF4F פונקציונלי והוא מוסדר באופן שלילי על ידי חלבוני מחייב eIF4E (4EBPs, חברים 1, 2 ו 3))6. על ידי מתחרה עם eIF4G מחייב eIF4E באמצעות ממשק המורכב רצפי איגוד eIF4E קנוני ולאקנוני 7,8,9 (אזור פורש aa 604-646 על eIF4E אנושי), 4EBP מפחית את המאגר של eIF4E מעורב באופן פעיל בתרגום ומניעת היווצרות מורכבת eIF4F. יחסי הגומלין של אינטראקציות חלבון חלבון אלה מוסדר בעיקר על ידי היעד היונקים של rapamycin (mTOR)בתיווך זרחון של 4EBP. על גירויים מיטוגניים, mTOR ישירות phosphorylates בני משפחת החלבון 4E-BP, הפחתת הקשר שלהם עם eIF4E ובכך, קידום אינטראקציה eIF4E-eIF4G והיווצרות של קומפלקסים eIF4Fפונקציונלי 10.
למרות המאמץ הגדול בפיתוח תרכובות מיקוד שלמות מורכבת eIF4F, חוסר מבחנים מדידת שיבוש ישיר של אינטראקציה eIF4E-eIF4G בתאים חיים הגביל את החיפוש אחר תרכובות פגע פעיל הסלולר. יישמנו מבחני לוציפראז המבוססים על אנלוגי coelenterazine (למשל, Nanoluc מבוסס משלים assay) כדי לפקח בזמן אמת את המצב של שלמות eIF4F באמצעות האינטראקציה eIF4E-eIF4G. מערכת החלבון המשלים של לוציפראז מורכבת מרסיס חלבון 18 kDa (SubA) ו-11 שברי פפטיד של חומצות אמינו (SubB) המותאמים למינימום שיוך עצמי ויציבות11. לאחר שהתבטא כמוצר היתוך עם eIF4E באורך מלא אנושי ותחום האינטראקציה eIF4E מ eiF4G1 האנושי (aa 604-646), שני חלבוני אינטראקציה יביא את שבר SubA ו SubB לקרבה של זה יגרום להיווצרות של לוציפראז פעיל כי, בנוכחות מצע חדיר לתא, בסופו של דבר יפיק אות זוהר בהיר(איור 1). דיווחנו במקום אחר על הבנייה והאימות של מערכת ההשלמה eIF4E:eIF4G604-646 16.
כאן, אנו מתארים כיצד ניתן להחיל את מערכת ההשלמה eIF4E:eIF4G604-646 (זמינה על פי בקשה) כדי למדוד במדויק הפרעות eIF4E-eIF4G בתיווך 4EBP1 בתאים חיים. בנוסף, אנו מדגימים את התועלת שלה על ידי מדידת ההשפעות של מספר מעכבי mTOR כי הם כיום תחת ניסויים קליניים כמו תרופות טיפוליות לסרטןפוטנציאליים 12. בגלל השפעות מחוץ ליעד לעתים קרובות להסוות פעילות ספציפית לסמים, אנו מתארים גם כיצד צדדיות של eIF4E:eIF4G604-646 מדידת המערכת ניתן להרחיב עם מדידות אורתוגונליות של הכדאיות הסלולר לקחת את אלה בחשבון.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת במאמר זה משתמשת בהשלמה מבוססת לוציפראז כדי לפקח כמותית על הרכבה מורכבת של eIF4F באמצעות מדידה ישירה של אינטראקציית eIF4G-eIF4E בתאים חיים. סיפקנו פרטים לשימוש במערכת השלמה eIF4E-eIF4G והראינו גם כי המערכת מדויקת ביותר במדידת ניתוק 4EBP1 בתיווך תרופות של אינטראקציה eIF4E-eIF4G16. על …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי תקציב הליבה של p53lab (BMSI, A * STAR) ומענק JCO VIP (A * STAR).
Materials
| 293FT cells | Thermo Fisher Scientific | R70007 | |
| Cell culture microplate 96 well, F-Bottom | greiner bio-one | 655083 | |
| Cell titer Glo 2.0 | PROMEGA | G9241 | |
| Envision Multilabel Reader | PerkinElmer | not applcable | |
| Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662070 | |
| Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662050 | |
| FUGENE6 | PROMEGA | E2692 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | |
| NanoBiT PPI Starter Systems | PROMEGA | N2014 | |
| Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | |
| Orbital shaker | Eppendorf | not appicable | |
| γ-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose | Jena Bioscience | AC-155S |
Riferimenti
- Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular Mechanism of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).
- Bhat, M., et al. Targeting the translation machinery in cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).
- Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development. Ricerca sul cancro. 75 (2), 250-263 (2015).
- Montanaro, L., Pandolfi, P. P. Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E. Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).
- Merrick, W. C. eIF4E: A retrospective. Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).
- Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G. Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).
- Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein. Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).
- Grüner, S., et al. The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation. Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).
- Gingras, A. C., et al. Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1. Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).
- Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Sun, S. Y. mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs. Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Sekiyama, N., et al. Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).
- Muller, D., et al. 4E-BP restrains eIF4E phosphorylation. Translation. 1 (2), e25819 (2013).
- Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly. BMC Biology. (1), 40 (2019).
- Ran, X., Gestwicki, J. E. Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area. Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).
