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Neuroscience

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में एक्सन डेथ के दौरान एक्सन ्सन और उनके सिनेप्स का रूपात्मक और कार्यात्मक मूल्यांकन

Published: March 16, 2020 doi: 10.3791/60865
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Fundamental Neurosciences, University of Lausanne
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम कटे एक्सोन और उनके सिनेप्स के रूपात्मक और कार्यात्मक संरक्षण का मूल्यांकन करने के लिए ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में तीन सरल चोट-प्रेरित एक्सोन डिजनरेशन (एक्सोन डेथ) परख करने के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

Abstract

एक्सॉन डिजनरेशन न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारी में एक साझा विशेषता है और जब तंत्रिका तंत्र यांत्रिक या रासायनिक बलों द्वारा चुनौती दी जाती है। हालांकि, एक्सॉन पतन अंतर्निहित आणविक तंत्र के बारे में हमारी समझ सीमित रहती है । चोट से प्रेरित एक्सॉन डिजनरेशन एक सरल मॉडल के रूप में कार्य करता है अध्ययन करने के लिए कैसे कटे एक्सोन अपनी अविधानसभा (एक्सॉन मौत) को निष्पादित करते हैं। हाल के वर्षों में, एक विकासवादी संरक्षित एक्सॉन मौत संकेत झरना मक्खियों से स्तनधारियों के लिए पहचान की गई है, जो अलग एक्सन के लिए चोट के बाद पतित करने के लिए आवश्यक है । इसके विपरीत, तनु हुआ एक्सॉन डेथ सिग्नलिंग परिणामस्वरूप कटे हुए एक्सोन और उनके सिनेप्स के रूपात्मक और कार्यात्मक संरक्षण में परिणाम होता है। यहां, हम तीन सरल और हाल ही में विकसित प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो एक्सोनल आकृति विज्ञान, या कटे हुए अक्षत के अक्षीय और सिनैप्टिक फ़ंक्शन के अवलोकन के लिए अनुमति देते हैं जिन्हें न्यूरोनल सेल शरीर से काट दिया गया है, फल फ्लाई ड्रोसोफिलामें। पंख में आकृति विज्ञान देखा जा सकता है, जहां एक आंशिक चोट के परिणामस्वरूप एक ही तंत्रिका बंडल के भीतर अघायल नियंत्रण अक्षों के साथ-साथ एक्सॉन मौत होती है। वैकल्पिक रूप से, मस्तिष्क में एक्सोनल आकृति विज्ञान भी देखा जा सकता है, जहां पूरे तंत्रिका बंडल एंटीनाल एब्लेशन से शुरू होने वाली एक्सॉन मौत से गुजरता है। कटे हुए एक्सोन और उनके सिनेप्स के कार्यात्मक संरक्षण का मूल्यांकन एक साधारण ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण द्वारा किया जा सकता है, जिसमें एक के बाद सिनैप्टिक ग्रूमिंग व्यवहार किया जाता है। हम एक हाईवायर लॉस-ऑफ-फंक्शन म्यूटेशन का उपयोग करके और अधिक व्यक्त करने वाले dnmnatद्वारा उदाहरण पेश करते हैं, दोनों सप्ताह से महीनों तक एक्सोन मौत में देरी करने में सक्षम हैं। महत्वपूर्ण बात, इन प्रोटोकॉल चोट से परे इस्तेमाल किया जा सकता है; वे न्यूरोनल रखरखाव कारकों, एक्सोनल परिवहन और एक्सोनल माइटोकॉन्ड्रिया के लक्षण वर्णन की सुविधा प्रदान करते हैं।

Introduction

जीवन भर निरंतर तंत्रिका तंत्र कार्य के लिए न्यूरॉन्स की रूपात्मक अखंडता आवश्यक है। न्यूरोनल मात्रा का विशाल बहुमत एक्सॉन1,2द्वारा लिया जाता है । इस प्रकार विशेष रूप से लंबे अक्षों का जीवन भर का रखरखाव तंत्रिका तंत्र के लिए एक प्रमुख जैविक और जैव ऊर्जावान चुनौती है। कई एक्सोनल-इंट्रानसिक और ग्लियल-एक्सट्रिन सपोर्ट मैकेनिज्म की पहचान की गई है, जिससे जीवन भर अक्षीय अस्तित्व सुनिश्चित किया गया है । उनकी हानि के परिणामस्वरूप एक्सॉन डिजनरेशन3होता है, जो तंत्रिका तंत्र की एक आम विशेषता है जिसे रोग में चुनौती दी जा रही है, और यांत्रिक या रासायनिक बलों द्वारा4,5। हालांकि, एक्सॉन पतन के अंतर्निहित आणविक तंत्र किसी भी संदर्भ में खराब समझ में आते रहते हैं, जिससे एक्सॉन हानि को चुनौतीपूर्ण बनाने के लिए प्रभावोत्पादक उपचार का विकास हो ताहै। इन न्यूरोलॉजिकल स्थितियों के खिलाफ प्रभावी उपचारों का विकास महत्वपूर्ण है, क्योंकि वे हमारे समाज में एक भारी बोझ पैदाकरतेहैं ।

चोट से प्रेरित एक्सॉन डिजनरेशन एक सरल मॉडल के रूप में कार्य करता है अध्ययन करने के लिए कैसे कटे एक्सोन अपने स्वयं के अassemblyपरे । 1850 में ऑगस्टस वालर के नाम से खोजा गया और नाम दिया गया, वालरियन डिजनरेशन (WD) एक छाता शब्द है जिसमें दो अलग, आणविक रूप से विभाज्य प्रक्रियाएं7शामिल हैं। सबसे पहले, अक्षीय चोट के बाद, अपने सेल निकायों से अलग होने वाले एक्सोन सक्रिय रूप से चोट8के बाद एक दिन के भीतर एक विकासवादी संरक्षित एक्सोन डेथ सिग्नलिंग झरना के माध्यम से अपने स्वयं के आत्म-विनाश (एक्सोन डेथ) को निष्पादित करते हैं। दूसरा, आसपास के ग्लिया और विशेष phagocytes संलग्न है और तीन से पांच दिनों के भीतर जिसके परिणामस्वरूप अक्षीय मलबे स्पष्ट । एक्सोन डेथ सिग्नलिंग के क्षीण होने के परिणामस्वरूप कटे हुए अक्षों9,10,11,12को हफ्तों तक संरक्षित रखा जाता है , जबकि ग्लियल छाई के क्षीण होने से अक्षत का मलबा खत्म हो जाता है जो विवो13,14,,15में हफ्तों तक बना रहता है ।

मक्खियों, चूहों, चूहों और जेब्राफिश में अनुसंधान से पता चला कि कई विकासवादी संरक्षित और एक्सोन मौत के आवश्यकमध्यस्थ8संकेत । एक्सॉन डेथ म्यूटेंट में कटे हुए एक्सोन और सिनेप्स होते हैं जो एक्सॉन डेथ से गुजरने में नाकाम होते हैं; सेल बॉडी सपोर्ट,9,,,,,10,12,,13,16,17,18,19,20 ,122121,22,23 ,23. इन मध्यस्थों की खोज और लक्षण वर्णन ने एक आणविक मार्ग की परिभाषा का नेतृत्व किया जो एक्सॉन मौत को क्रियांवित करता था। महत्वपूर्ण बात यह है कि एक्सोन डेथ सिग्नलिंग न केवल तब सक्रिय होती है जब एक्सन को काटा जाता है, कुचल दिया जाता है या24,25फैला होता है । यह न्यूरोलॉजिकल स्थितियों के विशिष्ट पशु मॉडलों में भी योगदानकर्ता प्रतीत होता है (उदाहरण के लिए, जहां एक्सोन चोट-स्वतंत्रतरीकेसे पतित होते हैं, फिर भी लाभकारी परिणामों की एक श्रृंखला के साथ4,,8)। इसलिए, यह समझना कि चोट के बाद एक्सॉन डेथ कैसे एक्सॉन डिजनरेशन निष्पादित करता है, यह समझना एक साधारण चोट मॉडल से परे अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है; यह भी चिकित्सकीय हस्तक्षेप के लिए लक्ष्य प्रदान कर सकता है ।

फल मक्खी ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर (ड्रोसोफिला)एक्सॉन डेथ सिग्नलिंग के लिए एक अमूल्य प्रणाली साबित हुई है। मक्खी में शोध से चार आवश्यक विकासवादी रूप से संरक्षित एक्सॉन मृत्यु जीन: हाईवायर (हिव)11,,14, dnmnat12,,26, dsarm10 और axundead (axed)12से पता चला । इन मध्यस्थों का संशोधन - हिव, डीएसआर्म और सोनेके नुकसान-समारोह उत्परिवर्तन, और dnmnat की अधिक अभिव्यक्ति - शक्तिशाली मक्खी के जीवन काल के लिए कुल्हाड़ी मौत ब्लॉक। जबकि कटे जंगली प्रकार के एक्सोन 1 दिन के भीतर कुल्हाड़ी मौत से गुजरते हैं, कटे एक्सोन और उनके सिनेप्स की कमी हिव, डीएसआर्म या कुल्हाड़ी न केवल रूपात्मक रूप से बनी हुई है, बल्कि कार्यात्मक रूप से हफ्तों तक संरक्षित भी है। क्या कार्यात्मक संरक्षण भी dnmnat के उच्च स्तर के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है निर्धारित किया जाना बाकी है ।

यहां, हम कोशिका शरीर के समर्थन के अभाव में एक्सॉन मृत्यु (उदाहरण के लिए, कटे एक्सन और उनके सिनेप्स के आकृति विज्ञान और कार्य) का अध्ययन करने के लिए तीन सरल और हाल ही में विकसित प्रोटोकॉल पेश करेंगे। हम प्रदर्शित करते हैं कि कटे हुए अक्षों में मृत्यु मृत्यु के परिणाम कैसे कटे हुए एक्सोन होते हैं जो एक हिव हानि-कार्य उत्परिवर्तन(hiw‧N)के साथ संरक्षित होते हैं और कैसे तनु एक्सोन मृत्यु के परिणामस्वरूप कटे हुए एक्सोन और सिनेप्स होते हैं जो कम से कम 7 दिनों तक कार्यात्मक रूप से संरक्षित रहते हैं, जिसमें dnmnat (dnmnatOE)की अधिक अभिव्यक्ति होती है। ये प्रोटोकॉल केंद्रीय, या परिधीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस और पीएन, क्रमशः)13,,14में व्यक्तिगत एक्सोनल और सिनैप्टिक आकृति विज्ञान के अवलोकन के लिए अनुमति देते हैं, जबकि सीएनएस में कटे हुए एक्सोन और उनके सिनेप्स के कार्यात्मक संरक्षण को व्यवहारपठन-परखेके रूप में संवारने के साथ संयोजन के साथ एक सरल ऑप्टोजेनेटिक सेटअप के उपयोग से कल्पना की जा सकती है।

Protocol

1. पीएनएस में एक्सॉन डेथ के दौरान एक्सॉन मॉर्फोलॉजी का अवलोकन

  1. विंग चोट: एक्सॉन बंडलों की आंशिक चोट
    1. कमरे के तापमान (आरटी) पर पार करने के लिए सही जीनोटाइप(चित्र4ए,पी0 पीढ़ी) से 5 कुंवारी महिलाओं और 5 पुरुषों का उपयोग करें। हर 3-4 दिनों में नई शीशियों में पी0 पास करें। ताजा रूप से संलग्न वयस्क संतान (एफ1 पीढ़ी) दैनिक लीजिए और उन्हें 7-14 दिनों के लिए उम्र।
    2. एनेस्थेटाइज़ सीओ2 पैड पर मक्खियों। पंख के बीच में लगभग पूर्वकाल पंख नस को काटने के लिए माइक्रो कैंची का उपयोग करें(चित्र ा 1ए)। चोट के लिए एक पंख का उपयोग करें और दूसरा पंख उम्र से मेल खाने वाले अघायल नियंत्रण के रूप में। प्रति पंख एक चोट लागू करें, और पर्याप्त पंख घायल (लगभग 15 पंख) प्राप्त करना सुनिश्चित करें।
      नोट: पूरे पंख के माध्यम से काटा जा सकता है, लेकिन यह केवल पूर्वकाल पंख नस में कटौती करने के लिए पर्याप्त है । यह विंग का सबसे मजबूत हिस्सा है।
    3. भोजन युक्त शीशियों में मक्खियों को ठीक करें।
  2. विंग विच्छेदन और एक्सोन का दृश्य
    1. एक पूरे ग्लास स्लाइड(चित्रा 1बी)के साथ एक पिपेट के साथ हेलोकार्बन तेल 27 के 10 μL फैलाएं ।
    2. घायलों को काट लें, साथ ही वांछित समय बिंदुओं पर अघायल नियंत्रण विंग (जैसे, 1 या 7 दिन बाद चोट)। पंख हड़पने के लिए काटने के लिए माइक्रो कैंची का उपयोग करें, और चिमटी। हेलोकार्बन तेल 27(चित्रा 1बी)में अधिकतम 4 पंखों माउंट और उन्हें एक कवर स्लाइड के साथ कवर।
    3. एक कताई डिस्क माइक्रोस्कोप का उपयोग कर तुरंत पंख छवि। जेड-एक्सिस के साथ ऑप्टिकल अनुभागों की एक श्रृंखला प्राप्त करें 0.33 माइक्रोन स्टेप-साइज के साथ और बाद के विश्लेषणों के लिए एक ही फ़ाइल में जेड-स्टैक को संपीड़न करें।
      नोट: पूर्वकाल पंख नस जहां सेल निकायों और अक्षतरखे हैं हड़पने मत करो। केंद्र में पंख पकड़ो। पंखों में ऊतक तय नहीं है; बढ़ते पंखों से समय 8 मिन के तहत इन इमेजिंग के लिए रखें।

Figure 1
चित्रा 1: पंख में एक्सॉन मौत के दौरान एक्सॉन आकृति विज्ञान का अवलोकन। (A)दो विरल जीएफपी लेबल वाले संवेदी न्यूरॉन्स के साथ योजनाबद्ध फ्लाई विंग, जो नीचे अलग से इंगित किया गया है। चोट की साइट और अवलोकन के क्षेत्र में संकेत दिया गया है। (ख)विंग इमेजिंग के लिए योजनाबद्ध सेटअप । घायल और अघायल नियंत्रण पंख (ग्रे) एक ग्लास स्लाइड (हल्के नीले) पर हेलोकार्बन तेल 27 (लाल) में घुड़सवार हैं और एक कवर स्लाइड (काले) के साथ कवर किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

2. सीएनएस में एक्सन डेथ के दौरान एक्सॉन और सिनेप्स आकृति विज्ञान का अवलोकन

  1. एंटीनाल एब्लेशन: पूरे एक्सॉन बंडलों की चोट
    1. आरटी में क्रॉस करने के लिए सही जीनोटाइप(चित्रा 5ए,पी0 जनरेशन) से 5 कुंवारी मादाओं और 5 पुरुषों का उपयोग करें। पी0 को हर 3-4 दिन में नई शीशियों में पास करें। ताजा रूप से संलग्न वयस्क संतान (एफ1 पीढ़ी) दैनिक लीजिए और उन्हें 7 से 14 दिनों के लिए उम्र दें।
    2. एनेस्थेटाइज़ सीओ2 पैड पर मक्खियों। एकतरफा एब्लेशन के लिए सही 3आरडी एंटीनाल सेगमेंट को त्यागने के लिए चिमटी का उपयोग करें; या द्विपक्षीय एब्लेशन के लिए बाएं और दाएं 3एंटीनाल सेगमेंट(चित्रा 2ए-सी)। इससे जीएफपी लेबल वाले न्यूरोनल सेल बॉडी दूर हो जाएंगी, जबकि उनके एक्सोनल अनुमान सीएनएस में बने हुए हैं।
      नोट: एंटीनाल एब्लेशन पूरे एक्सॉन बंडल को तोड़ता है। यदि एकतरफा एब्लेशन किया जाता है, तो कॉन्ट्रालेटरल साइड (अनबेटेड एंटीना) पर एक्सॉन बंडल आंतरिक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। पर्याप्त एंटीनाल एब्लेशन (लगभग 15 जानवर) करना सुनिश्चित करें।
    3. भोजन युक्त शीशियों में मक्खियों को ठीक करें।
  2. मस्तिष्क विच्छेदन और एक्सोन का दृश्य
    1. 10:1 के वॉल्यूम रेशियो में सिलिकॉन एल्स्टोमर बेस (9 मिली) और क्यूरिंग एजेंट (1 mL) मिलाएं। प्रत्येक 5 मिलील मिश्रण को 35 मिमी ऊतक संस्कृति प्लेट में स्थानांतरित करें, और रात भर धुएं के हुड में कोमल आंदोलन के साथ मिश्रण करके शुरू की गई हवा को कम करें। मिश्रण 24 घंटे के भीतर जम जाता है।
      नोट: विच्छेदन प्लेटें केवल एक बार तैयार की जानी चाहिए और कई बार इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    2. एनेस्थेटाइज़ सीओ2 पैड पर मक्खियों और वांछित समय बिंदुओं पर दो चिमटी का उपयोग करवयस्क सिर काटना (जैसे, 1 या 7 दिन एंटीनाल एब्लेशन के बाद)। गर्दन को हड़पने के लिए एक ट्वीज़र का उपयोग करें, और छाती को ठीक करने के लिए अन्य चिमटी। धीरे-धीरे गर्दन और सिर को छाती से खींचें।
      नोट: वांछित संख्या प्राप्त होने तक सीओ2 पैड पर सिर छोड़ दें, लेकिन 30 मिनट के भीतर अगले चरण में आगे बढ़ना सुनिश्चित करें।
    3. सभी सिरों को 1.5 मिलीएम माइक्रोसेंट्रिकफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें फिक्सिंग समाधान के 1 मिलीएल शामिल हैं जिसमें 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) और 0.1% ट्राइटन एक्स-100 फास्फेट बफर्ड लवलाइन (पीबीएस) में चिमटी का उपयोग करके।
      नोट: फ्लाई सिर गीले चिमटी पर अच्छी तरह से चिपके रहते हैं। यह माइक्रोसेन्ट्राइज ट्यूब में सभी सिरों को आसानी से स्थानांतरित करना संभव बनाता है।
    4. आरटी में कोमल आंदोलन के साथ 20 मिन के लिए सिर ठीक करें । बर्फ पर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब रखो, सिर माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब के नीचे करने के लिए झुकना होगा । एक पिपेट के साथ अधिनात को हटा दें और अवशिष्ट फिक्सिंग समाधान को हटाने के लिए, अवशिष्ट फिक्सिंग समाधान को हटाने के लिए, आरटी में कोमल आंदोलन के साथ पीबीएस में 0.1% ट्राइटन एक्स-100 युक्त वाशिंग बफर के 1 मिलील के साथ पांच 2 मिन वॉश के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएं।
      नोट: वयस्क ड्रोसोफिला दिमाग को विच्छेदन करने के तरीके पर वीडियो आसानी से उपलब्ध हैं27।
    5. एक कांच के पिपेट के साथ सिर को वाशिंग बफर से भरी विच्छेदन प्लेट में स्थानांतरित करें। एक चिमटी का प्रयोग करने के लिए हड़पने और सिर से सूंड खींचने के लिए, जबकि अंय tweezer के साथ सिर पकड़ । यह एक छेद छोड़ देंगे सूंड एक्सोस्केलेटन से जुड़ा हुआ था।
    6. छेद और प्रत्येक यौगिक आंख के बीच एक्सोस्केलेटन को हटाने के लिए दो चिमटी का उपयोग करें। यह दोनों चिमटी के साथ सिर संरचना को खोलना और मस्तिष्क को धीरे से खरोंच करने के लिए संभव बना देगा।
    7. श्वासनली या वसा को हटाकर प्रत्येक मस्तिष्क को साफ करें(चित्रा 2डी,शीर्ष)। एक बार मस्तिष्क साफ हो जाने के बाद, इसे बर्फ पर बफर धोने के 1 मिलील युक्त एक नई माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में डाल दें।
      नोट: क्षतिग्रस्त या खो ऑप्टिक पालि मस्तिष्क के केंद्र में घ्राण पालि को प्रभावित नहीं करेगा(चित्रा 2डी,शीर्ष)।
    8. सभी दिमाग एकत्र और माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब के तल पर जमा कर रहे हैं एक बार फिक्सिंग समाधान के 1 mL के साथ वाशिंग बफर की जगह। आरटी में कमाल के साथ 10 मिन के लिए दिमाग ठीक है, आरटी में कमाल के साथ बफर धोने के 1 mL में पांच 2 मिन धोता के बाद ।
    9. 4 डिग्री सेल्सियस पर कमाल के साथ रात भर बफर धोने में प्राथमिक एंटीबॉडी (1:500) लागू करें, इसके बाद आरटी में कमाल के साथ वाशिंग बफर के 1 mL का उपयोग कर2 एच पर 10 वॉश करें।
    10. आरटी में कमाल के साथ बफर 2 एच धोने में माध्यमिक एंटीबॉडी (1:500) लागू करें और प्रकाश को ब्लॉक करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब लपेटें। माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब को बाकी प्रक्रिया के लिए एल्यूमीनियम पन्नी से ढके रखें। आरटी में कमाल के साथ 2 घंटे से अधिक बफर धोने के 1 mL के साथ दस वॉश लागू करें ।
    11. अधिनेता को हटा दें और माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में दिमाग को कवर करने के लिए एंटीफीका रिएजेंट की एक बूंद का उपयोग करें। बढ़ते और इमेजिंग के लिए तैयार करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 30 सीन के लिए दिमाग इनक्यूबेट करें।
    12. एक कवर स्लाइड तैयार करें, उस पर लैब टेप चिपकाएं, और टेप से "टी" जैसी आकृति को काट ें(चित्रा 2डी,नीचे)। जिसके परिणामस्वरूप अंतरिक्ष क्षेत्र के रूप में कार्य करता है जहां मस्तिष्क युक्त एंटीफीका रिएजेंट28 में, अधिमानतः दोनों कक्षों में किया जाएगा ।
      नोट: एक 20-200 μL पिपेट टिप का उपयोग करें, जहां टिप के 3 मिमी काट दिया गया है पिपेट के उद्घाटन को चौड़ा करने के लिए । इससे ब्रेन युक्त एंटीफीका रिएजेंट को पिपेट करना संभव हो जाएगा। ध्यान से एक कवर स्लाइड के साथ दिमाग को कवर।
    13. दो छोटे भी रोल तैयार करने के लिए मिट्टी का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि मिट्टी के रोल ग्लास स्लाइड की ऊंचाई से अधिक नहीं हैं। ग्लास स्लाइड(चित्रा 2डी,नीचे) पर मिट्टी के रोल छड़ी। क्ले रोल पर मस्तिष्क युक्त कवर स्लाइड सैंडविच रखें।
      नोट: GFP लेबल अक्षत और उनके सिनेप्स मस्तिष्क के सामने स्थित हैं। इसलिए उन्हें सामने से इमेज देना आसान होता है। हालांकि, दिमाग या तो सामना करेंगे, या कवर स्लाइड सैंडविच पर नीचे का सामना करेंगे । क्ले रोल सैंडविच धारकों के रूप में सेवा करते हैं, और इमेजिंग के दौरान, सैंडविच उल्टा फ़्लिप किया जा सकता है । इससे हर मस्तिष्क से सामने से छवियां हासिल करना संभव हो जाएगा।
    14. एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 1.0 माइक्रोमीटर चरण-आकार के साथ जेड-एक्सिस के साथ ऑप्टिकल अनुभागों की एक श्रृंखला प्राप्त करें, और बाद के विश्लेषणों के लिए एक ही फ़ाइल में जेड-स्टैक को संपीड़न करें, ताकि अक्षत ित अनुमानों की संख्या का आकलन किया जा सके।

Figure 2
चित्रा 2: मस्तिष्क में एक्सॉन मृत्यु के दौरान एक्सॉन और सिनेप्स आकृति विज्ञान का अवलोकन। (A)जीएफपी लेबल वाले सेल बॉडी, एक्सॉन और सिनेप्स के साथ एक योजनाबद्ध फ्लाई हेड का साइड व्यू । (ख)जीपीएफ लेबल वाले घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स और उनके एक्सोन और सिनेप्स का उच्च आवर्धन फ्रंट व्यू । सेल निकायों 3एंटीनाल खंड में रखे जाते हैं, और उनके एक्सोन परियोजना सीएनएस में। एक्सॉन बाएं घ्राण पालि में ग्लोमेरिरुलस में सिनेप्स बनाते हैं, मिडलाइन को पार करते हैं और कॉन्ट्रालेटरल घ्राण पालि पर ग्लोमेरिरुलस में सिनेप्स बनाते हैं। (ग)एकतरफा एंटीना एब्लेशन के साथ फ्लाई हेड्स के उदाहरण। शीर्ष: अघायल नियंत्रण। मध्य: 3एंटीनाल सेगमेंट का एब्लेशन। नीचे: 2का एब्लेशन (और इस प्रकार 3rd)एंटीनाल सेगमेंट भी। (D)मस्तिष्क की तैयारी। शीर्ष: योजनाबद्ध विच्छेदित फ्लाई मस्तिष्क को देखने के क्षेत्र में इंगित घ्राण पालि और अक्षीय अनुमानों के साथ। नीचे: ब्रेन इमेजिंग के लिए योजनाबद्ध सेटअप। दो मिट्टी रोल (हरे) एक गिलास स्लाइड (हल्के नीले) पर मुहिम शुरू कर रहे हैं, वे एक कवर स्लाइड सैंडविच, जो मक्खी दिमाग (ग्रे) शामिल है ले । दिमाग एंटीफीका रिएजेंट (बैंगनी) में घुड़सवार हैं, जो एक प्रयोगशाला टेप (नारंगी) से घिरा हुआ है, और दो कवर स्लाइड (काला) से ढका हुआ है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

3. एक्सॉन और सिनेप्स फ़ंक्शन के लिए रीडआउट के रूप में ऑप्टोजेनेटिक्स द्वारा प्रेरित ग्रूमिंग

  1. ऑप्टोजेनेटिक सेटअप
    1. एक अंधेरे कमरे में ऑप्टोजेनेटिक प्रयोग करें। सुनिश्चित करें कि सेटअप में अंधेरे में मक्खियों को रोशन करने के लिए 850 एनएम इन्फ्रारेड (आईआर) एलईडी स्पॉटलाइट शामिल है(चित्रा 3ए),एक चमकती 660 एनएम लाल एलईडी स्पॉटलाइट सीचरिमसन को व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स को सक्रिय करने के लिए, और 700 एनएम लॉन्गपास फिल्टर के साथ मोनोक्रोम कैमरा, जो लाल बत्ती चमक की रिकॉर्डिंग को रोकता है।
    2. 1 सेमी व्यास के साथ एक छोटे से परिपत्र व्यवहार कक्ष उत्पन्न करने के लिए एक 3 डी प्रिंटर का उपयोग करें, इसे कवर स्लाइड के साथ कवर करें, और कक्ष के बगल में लाल एलईडी स्पॉटलाइट के साथ मिलकर 860 एनएम उत्सर्जक रखें(चित्रा 3बी)।
      नोट: उत्सर्जक इंगित करता है जब लाल एलईडी स्पॉटलाइट पर है, इस प्रकार न्यूरॉन्स को सक्रिय ।
    3. एलईडी स्पॉटलाइट माउंट और चैंबर के शीर्ष पर कैमरा(चित्रा 3ए, सी)।
    4. 10 एस के दौरान 10 हर्ट्ज चमक द्वारा न्यूरॉन्स सक्रिय करें। सक्रियण की अवधि को प्रायोगिक डिजाइन के अनुसार समायोजित किया जा सकता है।
  2. ऑप्टोजेनेटिक्स के लिए मक्खियों की तैयारी
    1. माइक्रोवेव में फ्लाई फूड पिघलाएं। भोजन ठंडा होने के बाद, ठोसकरण से पहले, 20 mM के 1:100 को इथेनॉल (EtOH) में सभी ट्रांस-रेटिना को 200 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें। अच्छी तरह से मिलाएं, और भोजन को तुरंत खाली शीशियों में डालें।
      नोट: गर्म भोजन के लिए सभी ट्रांस रेटिना जोड़ने से बचें, यह कम कुशल ऑप्टोजेनेटिक्स में परिणाम हो सकता है ।
    2. प्लग या कपास गेंदों के साथ जम भोजन युक्त शीशियों को कवर करें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ शीशियों लपेटें। इसके बाद खाने से युक्त शीशियों को अंधेरे, ठंडे कमरे में स्टोर करें।
    3. आरटी में पार करने के लिए सही जीनोटाइप से 5 कुंवारी महिलाओं और 5 पुरुषों(चित्र6ए,जेनरेशन पी0)का उपयोग करें । पी0 को हर 3-4 दिन में नई शीशियों में पास करें । एक दैनिक आधार पर हौसले से संलग्न वयस्क संतान (पीढ़ी एफ1)ले लीजिए और उन्हें एल्यूमीनियम से ढकी शीशियों में 7 से 14 दिनों के लिए उम्र-फ्लाई फूड में सभी ट्रांस-रेटिना युक्त 200 माइक्रोन युक्त शीशियों को दें।
    4. भोजन युक्त शीशियों से उन्हें भोजन युक्त शीशियों से कोई भोजन के साथ एक खाली शीशी में टैप करके मक्खियों को इकट्ठा करें। लगभग 30 एस के लिए बर्फ युक्त पानी में शीशी नीचे ठंडा । मक्खियों सो जाएगा । एक कवर स्लाइड(चित्रा 3बी)के साथ कवर छोटे कक्षों में तेजी से व्यक्तिगत मक्खियों रखो ।
      नोट: जैसे ही मक्खियों गर्म होते हैं, वे जाग जाते हैं। प्रत्येक कक्षों में व्यक्तिगत मक्खियों को जल्दी से फैलाना महत्वपूर्ण है। मक्खियों का एनेस्थेटाइज़ करने के लिए सीओ2 पैड से बचें, यह उनके व्यवहार को प्रभावित करेगा।
    5. एंटीनाल ग्रूमिंग प्राप्त करने के लिए ऑप्टोजेनेटिक्स करें। यहां, प्रोटोकॉल में निम्नलिखित अंतराल होते हैं: 30 एस जहां लाल बत्ती अनुपस्थित होती है, इसके बाद 10 हर्ट्ज पर 10 एस लाल बत्ती एक्सपोजर होता है। इस प्रक्रिया को कुल तीन बार दोहराएं, इसके बाद अतिरिक्त 30 एस अंतराल जहां लाल बत्ती अनुपस्थित होती है12,,29,,30।
      नोट: इस प्रोटोकॉल को प्रायोगिक वरीयता के अनुसार समायोजित किया जा सकता है।
    6. सीओ2 पैड पर प्रत्येक कक्ष से व्यक्तिगत मक्खियों को इकट्ठा करें। उन्हें एंटीनाल चोट के अधीन करें। बाएं और दाएं दोनोंएंटीनाल सेगमेंट(चित्रा 2सी)को एब्लेट करें । इससे जॉन्स्टन के ऑर्गन (जो) न्यूरॉन्स के सेल बॉडी जंच जाएंगे, जबकि एक्सोनल अनुमान सीएनएस में बने हुए हैं। 200 माइक्रोन सभी ट्रांस रेटिना युक्त एल्यूमीनियम से ढकी शीशियों में मक्खियों को ठीक करें।
      नोट: ऑप्टोजेनेटिक्स द्वारा प्रेरित एंटीनाल ग्रूमिंग के लिए, संवेदी न्यूरॉन सेल निकायों को 2nd एंटीनाल सेगमेंट(चित्रा 2सी)में रखे गए हैं।
    7. इसी समय बिंदुओं पर (उदाहरण के लिए, 7 दिन बाद एंटीनाल एब्लेशन), विषय एक और ग्रूमिंग परख के लिए उड़ता है (3.2.4 कदम पर वापस जाओ)।

Figure 3
चित्रा 3: ऑप्टोजेनेटिक सेटअप एक्सॉन और सिनेप्स फ़ंक्शन के लिए एक readout के रूप में ग्रूमिंग को प्रेरित करने के लिए। (A)ऑप्टोजेनेटिक्स के लिए आवश्यक इकट्ठे घटकों का चित्रण। इन्फ्रारेड (आईआर) एलईडी स्पॉटलाइट, कैमरा और लाल एलईडी स्पॉटलाइट (बाएं से दाएं, क्रमशः) । विस्तृत विवरण सहित घटक सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध हैं। (ख)लाल एलईडी स्पॉटलाइट सक्रियण को इंगित करने के लिए आईआर उत्सर्जक सहित एक व्यवहार कक्ष का शीर्ष दृश्य चित्रण। (ग)एक ही माउंट सेटअप का चित्रण। दो एलईडी स्पॉटलाइट और कैमरे के लिए क्रमशः कुल तीन माउंट सेटअप की आवश्यकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Representative Results

ऊपर, हमने कटे हुए एक्सोन और उनके सिनेप्स के आकृति विज्ञान और कार्य का अध्ययन करने के लिए तीन तरीकों का वर्णन किया। पहली विधि पीएनएस में व्यक्तिगत अक्षों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन अवलोकन के लिए अनुमति देती है। इसके लिए मार्एसएम तकनीक14,31से उत्पन्न क्लोन की आवश्यकता होती है . यहां, हमने जंगली प्रकार और हाईवायर उत्परिवर्ती मार्एसएम क्लोन(चित्रा 4ए)उत्पन्न करने के लिए क्रॉस किया। पंख के बीच में एक साधारण कटौती न्यूरॉन्स के एक्सोन चोट को प्रेरित करती है जो पंख के बाहरी हिस्से में डिस्टल (उदाहरण के लिए), जबकि समीपस्थ न्यूरॉन्स (जैसे, कट साइट और छाती के बीच) अघायल रहते हैं। यह दृष्टिकोण एक ही तंत्रिका बंडल(चित्रा 1ए, चित्रा 4बी)में अघायल नियंत्रण अक्षों के साथ-साथ एक्सोन मौत का पालन करना संभव बनाता है। यहां, हमने एक आनुवंशिक पृष्ठभूमि का उपयोग किया जिसके परिणामस्वरूप जीएफपी-लेबल क्लोन (जैसे, प्रत्येक प्रयोग14में दो) की संख्या कम होती है। हम जंगली प्रकार के एक्सोन की चोट के बाद 1 और 7 दिनों के उदाहरण पेश करते हैं, नियंत्रण एक्सोन के उदाहरण प्रदान करने के लिए, एक्सॉन मौत से गुजर रहे एक्सोन, और एक्सोन लक टुकड़ों को क्रमशः आसपास के ग्लिया द्वारा मंजूरी दी जा रही है। इसके अलावा, हमने हाईवायर म्यूटेंट में एक्सोनल इंजरी दोहराई जहां हमने चोट के 7 दिन बाद परिणाम का विश्लेषण किया।

अघायल नियंत्रण पंख दो जंगली प्रकार के क्लोन बंदरगाह, इस प्रकार दो GFP लेबल जंगली प्रकार के अक्षतों(चित्र4बी,जंगली प्रकार, अघायल नियंत्रण) । माइक्रो कैंची के उपयोग से पंख के बीच काटने के एक दिन बाद, एक्सॉन मौत GFP लेबल एक्सोन में प्रेरित किया जाता है जहां सेल निकायों कट साइट के लिए डिस्टर्ब होते हैं, जबकि समीपस्थ रूप से रखे गए सेल निकायों से एक्सोन एक ही तंत्रिका बंडल के भीतर आंतरिक नियंत्रण के रूप में काम करते हैं(चित्रा 4बी,जंगली प्रकार, 1 दिन के बाद चोट)। तीर द्वारा इंगित ऊपरी हिस्से में एक्सोनल मलबे का पता लगाते हुए ध्यान दें। अक्षीय चोट के 7 दिन बाद, GFP लेबल एक्सोनल मलबे आसपास के ग्लिया द्वारा मंजूरी दे दी है, जबकि GFP अघायल नियंत्रण अक्षत लेबल तंत्रिका बंडल में रहते है(चित्रा 4बी,जंगली प्रकार, 7 दिन के बाद चोट, तीर) । इसके विपरीत, 7 दिनों के लिए कटे हुए हाईवायर उत्परिवर्ती अक्षों को रूपात्मक रूप से संरक्षित किया गया है, जो पिछले निष्कर्षों11,,14 (चित्रा 4बी, हाईवायर,7 दिनों के बाद चोट, तीर) के अनुरूप है। ये परिणाम ड्रोसोफिला विंग के शक्तिशाली दृश्य संकल्प को प्रदर्शित करते हैं। एक्सॉन मौत को एक ही तंत्रिका बंडल में अघायल नियंत्रणों के साथ-साथ देखा जा सकता है। जबकि जंगली प्रकार के एक्सोन चोट के बाद 1 दिन के भीतर कुल्हाड़ी मौत से गुजरते हैं और परिणामस्वरूप मलबे को 7 दिनों के भीतर मंजूरी दे दी जाती है, एक्सॉन मौत की कमी हाईवायर म्यूटेंट 7 दिनों के लिए रूपात्मक रूप से संरक्षित रहते हैं।

Figure 4
चित्रा 4: विंग में GFP लेबल संवेदी न्यूरॉन एक्सोन की एक्सोन मौत का अध्ययन करने के लिए दृष्टिकोण। (A)योजनाबद्ध पंख (पी0 और एफ1 पीढ़ी, क्रमशः) में जंगली प्रकार और हाईवायर क्लोन उत्पन्न करने के लिए पार करता है। कुंवारी मादाएं बाईं ओर होती हैं, दाईं ओर पुरुष। जीनोटाइप विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें। (ख)नियंत्रण और घायल जीएफपी लेबल वाले एक्सोन के उदाहरण । देखने के क्षेत्र में संकेत दिया गया है(चित्रा 1ए)। बाएं से दाएं: अघायल जंगली प्रकार नियंत्रण एक्सोन, जंगली प्रकार के एक्सोन 1-दिन पोस्ट इंजरी, वाइल्ड टाइप एक्सोन 7 दिन बाद चोट, हाईवायर म्यूटेंट एक्सोन 7 दिन बाद चोट, क्रमशः। तीर कटे हुए एक्सोन, स्केल बार = 5 माइक्रोन का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

दूसरी विधि का वर्णन कैसे सीएनएस में पेश पूरे एक्सोन बंडलों की कल्पना करने के लिए जहां वे synapses, जो दोनों बाएं और सही एंटीना में रखे न्यूरॉन्स के हैं(चित्रा 2ए-सी)। यहां, हमने जंगली प्रकार और हाईवायर उत्परिवर्ती मार्एसएम क्लोन(चित्रा 5ए)उत्पन्न करने के लिए क्रॉस किया। चोट के अभाव में अघायल, जीएफपी-लेबल वाले एक्सोन और उनके सिनेप्स की कल्पना दिनों से सप्ताह तक की कल्पना की जा सकती है, चोट की अनुपस्थिति में(चित्रा 5बी,जंगली प्रकार, अघायल नियंत्रण)। वैकल्पिक रूप से, जानवरों को 3एंटीनाल सेगमेंट एब्लेशन के अधीन किया जा सकता है, और कटे जीएफपी-लेबल वाले एक्सोन और उनके सिनेप्स को घंटों से दिनों में एक समय पाठ्यक्रम के दौरान देखा जा सकता है। हमने एंटीनाल एब्लेशन के 7 दिनों बाद ध्यान केंद्रित किया, क्योंकि इस समय, एक्सोन और उनके सिनेप्स को एक्सॉन मौत मिली है, और जिसके परिणामस्वरूप मलबे को आसपास के ग्लिया द्वारा मंजूरी दे दी जाती है। यदि सही एंटीना का एकतरफा एब्लेशन किया जाता है, तो सही एक्सॉन बंडल को कटे हुए किया जाता है और अलग हो जाएगा और परिणामस्वरूप मलबे को चोट के 7 दिन बाद पूरी तरह से मंजूरी दे दी जाती है(चित्रा 5बी,जंगली प्रकार, एकतरफा एब्लेशन, 7 दिन बाद चोट, तीर), पिछले निष्कर्षों के अनुरूप13। वैकल्पिक रूप से, दाएं और बाएं एंटीना दोनों को बरी किया जा सकता है, जो दोनों एक्सॉन बंडलों को तोड़ देगा, और चोट के 7 दिन बाद, एक्सोन और उनके सिनेप्स गायब हो गए(चित्र5बी,जंगली प्रकार, द्विपक्षीय एब्लेशन, 7 दिन बाद चोट, तीर)। इसके विपरीत, हाईवायर म्यूटेंट में सही एंटीना के एकतरफा एब्लेशन के परिणामस्वरूप कटे हुए एक्सोन होते हैं जो चोट के बाद 7 दिन संरक्षित रहते हैं, पिछले निष्कर्षों के अनुरूप11, 14,14 (चित्रा 5बी, हाईवायर,एकतरफा एब्लेशन, 7 दिन बाद चोट, तीर)। इन परिणामों से पता चलता है कि कटे जंगली प्रकार के एक्सोन एक्सोन मौत से गुजरते हैं और परिणामस्वरूप मलबे को 7 दिनों के भीतर मंजूरी दे दी जाती है, जबकि एक्सॉन मौत की कमी हाईवायर म्यूटेंट कुल्हाड़ी की मौत से गुजरने में विफल रहते हैं और 7 दिनों तक रूपात्मक रूप से संरक्षित रहते हैं।

Figure 5
चित्रा 5: मस्तिष्क में GFP लेबल संवेदी न्यूरॉन एक्सोन की एक्सोन मौत का अध्ययन करने के लिए दृष्टिकोण। (A)योजनाबद्ध मस्तिष्क में जंगली प्रकार और हाईवायर क्लोन उत्पन्न करने के लिए पार करता है (क्रमशः पी0 और एफ1 पीढ़ी)। कुंवारी मादाएं बाईं ओर होती हैं, दाईं ओर पुरुष। जीनोटाइप विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें। (ख)नियंत्रण और घायल जीएफपी लेबल वाले एक्सोन के उदाहरण । बाएं से दाएं: अघायल जंगली प्रकार नियंत्रण, जंगली प्रकार 7 दिन बाद एकतरफा एंटीनाल एब्लेशन, जंगली प्रकार 7 दिन बाद द्विपक्षीय एंटीनाल एब्लेशन, और हाईवायर म्यूटेंट क्रमशः एकतरफा एंटीनाल एब्लेशन के बाद 7 दिन। तीर कटे हुए एक्सॉन बंडलों, स्केल बार = 10 माइक्रोन का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तीसरी विधि सीएनएस में कटे हुए एक्सोन और उनके सिनेप्स के कार्यात्मक संरक्षण के अवलोकन के लिए अनुमति देती है। यह 2nd एंटीनाल सेगमेंट में रखे गए जो न्यूरॉन्स के सबसेट के हेरफेर पर निर्भर करता है जो एंटीनाल ग्रूमिंग को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त हैं। जो न्यूरॉन्स में लाल-स्थानांतरित चैनलोडोप्सिन (सीएसचिरिसन) की अभिव्यक्ति, सभी ट्रांस-रेटिना के आहार पूरकके साथ संयुक्त, लाल प्रकाश एक्सपोजर12,,30पर एक सरल पोस्ट-सिनैप्टिक ग्रूमिंग व्यवहार प्रकाश में लाने के लिए पर्याप्त है। यहां, हमने जंगली प्रकार के जो न्यूरॉन्स उत्पन्न करने के लिए क्रॉस किया, और जो न्यूरॉन्स अधिक व्यक्त करने वाले dnmnat (dnmnatOE)(चित्रा 6ए)। जंगली प्रकार मक्खियों या मक्खियों तनु एक्सॉन मौत(dnmnatOE)के साथ जो न्यूरॉन्स युक्त, दोनों चोट से पहले एक शक्तिशाली सौंदर्य व्यवहार बंदरगाह । हालांकि, 7 दिन के बाद चोट (जैसे, 2nd एंटीनाल खंड के द्विपक्षीय ablation), सौंदर्य के लिए जंगली प्रकार में ऑप्टोजेनेटिक्स द्वारा प्राप्त करने में विफल रहता है चोट प्रेरित एक्सन और सिनेप्स पतन के कारण मक्खियों, जबकि तनु एक्सॉन मौत के साथ जानवरों को दूल्हे के लिए जारी(चित्रा 6बी, फिल्म 1,2)। इसलिए तनु एक्सॉन मौत 7 दिनों के लिए कटे हुए एक्सोन और उनके सिनेप्स को कार्यात्मक रूप से संरक्षित करने में सक्षम है।

Figure 6
चित्रा 6: एक्सोटॉमी के बाद एक्सोनल और सिनैप्टिक फ़ंक्शन की कल्पना करने के लिए दृष्टिकोण। (ए)योजनाबद्ध पार जंगली प्रकार और dnmnat अधिक व्यक्त जो संवेदी न्यूरॉन्स (पी0 और एफ1 पीढ़ी, क्रमशः) उत्पंन करने के लिए । कुंवारी मादाएं बाईं ओर होती हैं, दाईं ओर पुरुष। जीनोटाइप विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें। (ख)ऑप्टोजेनेटिक्स द्वारा प्रेरित ग्रूमिंग व्यवहार के व्यक्तिगत एथोग्राम। शीर्ष: जंगली प्रकार के व्यक्तिगत एथोग्राम चोट (नीला) के 7 दिन पहले और 7 दिन बाद उड़ता है। नीचे: मक्खियों के व्यक्तिगत ethograms से पहले और 7 दिन चोट (लाल) जो न्यूरॉन्स में dnmnat (dnmnatOE)व्यक्त । प्रत्येक बिन 1 एस के भीतर कम से कम 1 ग्रूमिंग व्यवहार इंगित करता है। काली रेखा सभी डिब्बे के योग को इंगित करती है। (ग)सौंदर्य व्यवहार का परिमाणीकरण। डेटा को औसत ± मानक विचलन, पी एंड जीटी; 0.001 (एक-तरफा ANOVA, Tukey के पोस्ट हॉक परीक्षण के साथ कई तुलना) के रूप में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

मूवी 1: एंटीना लम्बे के 7 दिन पहले और 7 दिनों से पहले ऑप्टोजेनेटिक्स द्वारा प्राप्त प्रतिनिधि जंगली प्रकार संवारने व्यवहार। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

मूवी 2: रिप्रेजेंटेटिव ग्रूमिंग व्यवहार मक्खियों में ऑप्टोजेनेटिक्स द्वारा प्राप्त-जो न्यूरॉन्स में पहले और 7 दिनों से पहले एंटीनाल एब्लेशन के बाद dnmnat व्यक्त । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल आकृति विज्ञान के मजबूत और प्रजनन योग्य अवलोकन के साथ -साथ एक्सोन के कार्य और उनके सिनेप्स को ड्रोसोफिलामें अपने कोशिका निकायों से अलग करने की अनुमति देते हैं। पंख परख पीएनएस14में अघायल नियंत्रण अक्षों के साथ-साथ एक्सोन डेथ के अवलोकन की सुविधा प्रदान करता है, जबकि एंटीनाल परख जीएफपी-लेबल वाले एक्सोन और उनके सिनेप्स के पूरे तंत्रिका बंडलों के अवलोकन की सुविधा प्रदान करता है, ताकि मस्तिष्क (सीएनएस)12में आकृति विज्ञान और कार्य दोनों का आकलन किया जा सके। रूपविज्ञान का अध्ययन करने के लिए प्रत्येक दृष्टिकोण के लिए महत्वपूर्ण कदम और कुछ फायदे हैं जिन्हें प्रयोगों को डिजाइन करते समय ध्यान में रखना होगा।

विंग में पीएनएस में एक्सॉन आकृति विज्ञान का निरीक्षण करने के लिए, विंग की पारदर्शिता के कारण प्रयोगों को आसानी से किया जा सकता है: यह विच्छेदन और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री को बाईपास करने की अनुमति देता है। हालांकि, निर्धारण की कमी के कारण, पंखों को14बढ़ते के तुरंत बाद चित्रित करना होगा। वर्तमान में, दो अलग-अलग Gal4 ड्राइवरों का अक्सर उपयोग किया जाता है, या तो ok371Gal4 या dpr1Gal4,और दोनों संदर्भ14,,26को डिजनुन करने के लिए अलग दृष्टिकोण प्रदान करते हैं। कुछ न्यूरॉन्स की विरल लेबलिंग की सिफारिश की जाती है, "दमनकारी सेल मार्कर (मार्कम) के साथ मोज़ेक विश्लेषण"14,,31का उपयोग करके, क्योंकि एक्सोनल मॉर्फोलॉजी का संकल्प अभूतपूर्व है। इसके विपरीत, पंखों में सिनेप्स का अवलोकन संभव नहीं है, वे मक्खियों के छाती के अंदर वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड में स्थित हैं। इसके अलावा, अतिरिक्त एक्सोनल मार्कर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा कल्पना नहीं की जा सकती: मोमी छल्ली अंतर्निहित ऊतक में फिक्सेटिव और एंटीबॉडी के प्रसार के लिए असंभव बनाता है।

सीएनएस में एक्सॉन और सिनेप्स आकृति विज्ञान का निरीक्षण करने के लिए, मस्तिष्क विच्छेदन को किया जाना चाहिए। वे इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के उपयोग से अतिरिक्त एक्सोनल और सिनैप्टिक मार्कर की कल्पना करने का लाभ प्रदान करते हैं, और दृश्य10,,13के समान क्षेत्र में एक्सोन के साथ सिनेप्स देखे जा सकते हैं। विशेषता घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन (ORN) Gal4 ड्राइवरों का एक बड़ा संग्रह आसानी से उपलब्धहै 32,और अक्सर, OR22aGal4 पसंद का चालक है। एंटीनाल एब्लेशन के लिए, OR22a न्यूरॉन्स के सेल निकायों 3खंड (चित्रा 2बी)में रखे जाते हैं । फ्लोरेसेंस तीव्रता आधारित क्वांटिफिकेशन का उपयोग एक्सॉन या सिनेप्स13के पतन की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है। इसके विपरीत, प्रयोग मस्तिष्क विच्छेदन और एंटीबॉडी धुंधला के कारण समय लेने वाले होते हैं।

एक्सोटॉमी के बाद एक्सोनल और सिनैप्टिक फंक्शन की कल्पना करने के लिए, ऑप्टोजेनेटिक्स का उपयोग एंटीनाल ग्रूमिंग को ट्रिगर करने के लिए किया जाता है: यह कटे हुए एक्सोन और उनके सिनेप्स12के कार्यात्मक संरक्षण के लिए एक रीडआउट के रूप में कार्य करता है। ग्रूमिंग सर्किट और इसी संवेदी, अंतर और मोटरन्यूरॉन Gal4 ड्राइवरों को अच्छी तरह से29,,30वर्णित किया गया है । GMR60E02Gal4 जॉन्स्टन के अंग (JO) संवेदी न्यूरॉन्स का एक सबसेट लेबल है, जो आवश्यक है और29,,30को संवारने के लिए पर्याप्त है । एंटीनाल एब्लेशन के लिए, जो न्यूरॉन्स के सेल निकायों को 2एंटीनाल सेगमेंट(चित्रा 2बी)में स्थित किया जाता है। एक ऑप्टोजेनेटिक सेटअप आसानी से खरोंच से बनाया जा सकता है, या एक मौजूदा सेटअप समायोजित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात, प्रयोगों को एक अंधेरे कमरे में किया जाना है, और मक्खियों इस प्रकार एक अवरक्त (आईआर) एलईडी स्पॉटलाइट के साथ कल्पना की जाती है। जब एक चैनल के रूप में CsChrimson का उपयोग कर, यह सभी ट्रांस रेटिना और एक लाल एलईडी स्पॉटलाइट के साथ भोजन की आपूर्ति के लिए जो न्यूरॉन्स29सक्रिय महत्वपूर्ण है । वैकल्पिक रूप से, नीली रोशनी के प्रति संवेदनशील चैनल और एक नीली एलईडी स्पॉटलाइट, या TrpA1 चैनल और तापमान का उपयोग न्यूरोनल एक्टिवेशन29,,33के लिए किया जा सकता है। सौंदर्य व्यवहार की मात्रा पहले ही12,29बताई जा चुकी है .

जब इन परखों का उपयोग विशेष रूप से एक्सॉन मृत्यु का अध्ययन करने के लिए किया जाता है, तो यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि समय के साथ रूपात्मक या कार्यात्मक संरक्षण का फेनोटाइप मजबूत होना चाहिए। ऐसे मामले हैं जहां एक्सोन मृत्यु34,,35में लगातार अभी तक कम स्पष्ट फेनोटाइप की ओर ले जाती है, और क्या इस तरह का फेनोटाइप कार्यात्मक संरक्षण में अनुवाद करता है, निर्धारित किया जाना बाकी है।

ड्रोसोफिला लार्वा के विकास के दौरान न्यूरॉन्स में एक्सोन डेथ फेनोटाइप भी देखा गया है, जहां11,,23घायल होने के बजाय नसों को कुचल दिया गया था। यहां, हमने विशेष रूप से वयस्क ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स पर ध्यान केंद्रित किया जो विकास पूरा करते थे। इस संदर्भ में आरएनए हस्तक्षेप३६,या ऊतक-विशिष्ट CRISPR/Cas9३७ का उपयोग आसानी से लागू किया जा सकता है । महत्वपूर्ण बात यह है कि उपरोक्त तकनीकों का उपयोग एक एक्सॉन डेथ स्वतंत्र संदर्भ में किया जा सकता है: वे न्यूरोनल रखरखावकारकों 38,एक्सोनल परिवहन39,आयु-निर्भर एक्सोनल माइटोकॉन्ड्रिया के लक्षण वर्णन को सुविधाजनक बनाते हैं,40बदलते हैं, और एक्सोनल माइटोकॉन्ड्रिया41की आकृति विज्ञान।

Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम योगदान के लिए पूरे न्यूकोम लैब का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । इस काम को स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (एसएनएसएफ) के असिस्टेंट प्रोफेसर अवार्ड (ग्रांट 176855), इंटरनेशनल फाउंडेशन फॉर रिसर्च इन पैराप्लेजिया (आईआरपी, ग्रांट पी180), एसएनएसएफ स्पार्क (ग्रांट 190919) और यूनिवर्सिटी ऑफ लुसाने से समर्थन देकर सपोर्ट किया गया था और एलजेएन को मौलिक तंत्रिका विज्ञान विभाग (एटडी वॉड) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tweezers (high precision, ultra fine) EMS 78520-5 Antennal ablation
MicroPoint Scissors (5-mm cutting edge) EMS 72933-04 Wing injury
1.5 mL microcentrifuge tube Eppendorf 30120086.0000
35mm tissue culture dish Sarstedt 83.3900
Cover Slips, Thickness 1 Thermo Scientific™ BB02400600A113MNT0
Superfrost Microscope Slides Thermo Scientific™ AA00008032E00MNT10
High-Sensitivity USB 2.0 CMOS Camera, 1280 x 1024, Global Shutter Thorlabs DCC1240M Camera setup
SM1 Retaining Ring for Ø1" Lens Tubes and Mounts Thorlabs SM1RR
25mm 1/1.2" C mount Lens Tamron M112FM25
Adapter with External M27 x 0.5 Threads and Internal SM1 Threads Thorlabs SM1A36
Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm Thorlabs ACL2520U-B
Ø25.0 mm Premium Longpass Filter, Cut-On Wavelength: 700 nm Thorlabs FELH0700
SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long Thorlabs SM1T2
SM1 Lens Tube Without External Threads, 1" Long, Two Retaining Rings Included Thorlabs SM1M10
850 nm, 900 mW (Min) Mounted LED, 1200 mA Thorlabs M850L3 IR LED spotlight
SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long Thorlabs SM1T2
SM1 Lens Tube Without External Threads, 2" Long, Two Retaining Rings Included Thorlabs SM1M20
Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm Thorlabs ACL2520U-B
Ø25.0 mm Premium Longpass Filter, Cut-On Wavelength: 850 nm Thorlabs FELH0850
SM1 Retaining Ring for Ø1" Lens Tubes and Mounts Thorlabs SM1RR
660 nm, 940 mW (Min) Mounted LED, 1200 mA Thorlabs M660L4 Red LED spotlight
Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm Thorlabs ACL2520U-B
SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long Thorlabs SM1T2
SM1 Lens Tube Without External Threads, 2" Long, Two Retaining Rings Included Thorlabs SM1M20
15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube Thorlabs KPS101 LED control
T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current Thorlabs LEDD1B
150 mm x 300 mm x 12.7 mm Aluminum Breadboard, M6 Double-Density Taps Thorlabs MB1530/M Mount base
Ø12.7 mm Universal Post Holder, Spring-Loaded Locking Thumbscrew, L = 75 mm Thorlabs UPH75/M Mount, 3x (IR LED, red LED, cam)
Ø1.20" Slip Ring for SM1 Lens Tubes and C-Mount Extension Tubes, M4 Tap Thorlabs SM1RC/M
Ø12.7 mm Optical Post, SS, M4 Setscrew, M6 Tap, L = 150 mm Thorlabs TR150/M
Ø12.7 mm Optical Post, SS, M4 Setscrew, M6 Tap, L = 40 mm Thorlabs TR40/M
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Posts, 5 mm Hex Thorlabs RA90/M
M6 x 1.0 Stainless Steel Cap Screw, 16 mm Long, Pack of 25 Thorlabs SH6MS16 screws for mount onto base
USB-6001 14-Bit 20 kS/s Multifunction I/O and NI-DAQmx National Instruments 782604-01 Red LED spotlight controller
20k Ohm 1 Gang Linear Panel Mount Potentiometer TT Electronics/BI P230-2EC22BR20K fintuner for indicator
IR (860nm) emitter, 100 mA radial Osram 475-1365-ND Red light indicator
cable - - Misc
All-trans retinal Sigma R2625
Ethanol absolute Vwr 20821.296
Halocarbon Oil 27 Sigma H8773
Mowiol Merk 81381
Paraformaldehyde Sigma F8775
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P5493
Sylgard 184 silicone elastomer base Dow Corning Corp 4019862
Sylgard 184 silicone elastomer curing agent Dow Corning Corp 4019862
Triton X-100 Sigma T8787
Chicken anti-GFP antibodies Rockland 600-901-215 Antibodies
Goat Dylight anti-Chicken Abcam ab96947
FM7a, B BDSC RRID:BDSC_785 X chromosome
FRT19A[hs-neo] BDSC RRID:BDSC_1709
hiw[ΔN] BDSC RRID:BDSC_51637
hs-FLP[12] BDSC RRID:BDSC_1929
tub-Gal80[LL1] BDSC RRID:BDSC_5132
w[1118] BDSC RRID:BDSC_3605
20xUAS-IVS-CsChrimson::mVenus BDSC RRID:BDSC_55135 2nd chromosome
5xUAS-Gal4[12B] Kyoto RRID:Kyoto_108492
5xUAS-HA::dnmnat BDSC RRID:BDSC_39702
5xUAS-mCD8::GFP[LL5] BDSC RRID:BDSC_5134
ase-FLP[2d] Freeman laboratory Neukomm et al., 2014 (PNAS)
CyO BDSC RRID:BDSC_2555
dpr1-Gal4 BDSC RRID:BDSC_25083
OR22a-Gal4 BDSC RRID:BDSC_9952
ey-FLP[6] BDSC RRID:BDSC_5577 3rd chromosome
GMR60E02-Gal4 BDSC RRID:BDSC_39250
TM3,Sb,e BDSC RRID:BDSC_3644

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References

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Paglione, M., Rosell, A. L., Chatton, J. Y., Neukomm, L. J. Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (157), e60865, doi:10.3791/60865 (2020).

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