Microwaving og Fluorophore-Tyramid for Multiplex Immunfarvning på Mouse Adrenals − Brug af ukonjugerede primære antistoffer fra samme værtsart
Summary
Der er etableret flere forskellige metoder til multipleximmunfarvning ved hjælp af primære antistoffer fra samme værtsart. Her beskriver vi brugen af mikrobølgemedieret antistofstripning og fluorophore-tyramid til at blokere antistofkrydsreaktivitet under multipleximmunfarvning på formalin-fast paraffin-indlejrede musebinyresektioner.
Abstract
Immunfarvning er meget udbredt i biomedicinsk forskning for at vise cellulære udtryk mønster af et givet protein. Multiplex immunfarvning tillader mærkning ved hjælp af flere primære antistoffer. For at minimere antistofkrydsreaktivitet kræver multipleximmunfarvning ved hjælp af indirekte farvning umærkede primære antistoffer fra forskellige værtsarter. Den passende kombination af forskellige arters antistoffer er dog ikke altid tilgængelig. Her beskriver vi en metode til brug af ikke-mærkede primære antistoffer fra de samme værtsarter (f.eks. i dette tilfælde er begge antistoffer fra kanin) for multiplex immunfluorescens på formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) musebinyresektioner. Denne metode bruger den samme procedure og reagenser, der anvendes i antigen hentning trin til at fratage aktiviteten af den tidligere farvede primære antistof kompleks. Dias blev plettet med det første primære antistof ved hjælp af en generel immunfarvningsprotokol efterfulgt af et bindende trin med et biotinylated sekundært antistof. Derefter blev en avidin-biotin-peroxidase signal udviklingsmetode brugt med fluorophore-tyramid som substrat. Immunaktiviteten i det første primære antistofkompleks blev strippet gennem nedsænkning i en mikroovnkogende natriumcitratopløsning i 8 min. Den uopløselige fluorophore-tyramid deposition forblev på prøven, som gjorde det muligt at plette diaset med andre primære antistoffer. Selv om denne metode eliminerer de fleste falske positive signaler, nogle baggrund fra antistof cross-reaktivitet kan forblive. Hvis prøverne beriges med endogen biotin, kan der anvendes et peroxidasekonjugeret sekundært antistof til at erstatte det biotonerede sekundære antistof for at undgå det falske positive fra genvundet endogen biotin.
Introduction
Ved multiplex immunfarvning, direkte farvning ved hjælp af konjugerede primære antistoffer kan give informative resultater. Uden at bruge sekundære antistoffer har den direkte farvningsmetode en lav risiko for falske colokaliseringssignaler fra antistofkrydsreaktivitet. Men, de konjugerede journalister (fluorophore, enzymer) eller biotin på den primære antistof begrænse dens fremtidige anvendelse. Alternativt giver indirekte immunfarvning normalt stærkere signaler ved hjælp af et ubøjeligt primært antistof med et mærket sekundært antistof. Ideelt set bør ukonjugerede primære antistoffer, der anvendes til multiplex immunfarvning, komme fra forskellige værtsarter for at undgå antistofkrydsreaktivitet. Den passende kombination af primære antistoffer fra forskellige værtsarter er imidlertid ikke altid tilgængelig.
Der er etableret flere metoder til at eliminere risikoen for, at det sekundære antistof reagerer med et uønsket primært antistof. En fælles metode er brugen af et F(ab) monomerisk antistof til at blokere eventuelle resterende bindende epitoper på det første primære antistofkompleks, før det farvning med det andet primære antistof1farvning . Antistof stripning, som svarer til strimlen og reprobe af en vestlig blot ark, fjerner den tidligere farvede antistof kompleks uden stripning af placeringen af påviselige reporter molekyler såsom 3,3′-diaminobenzidin tetrahydrochlorid (DAB)2 og fluorescerende tyramid deposition3. Med denne metode kan reportermolekyler i forskellige farver vise et multiplexresultat på samme dias. Multiplex-farvningen kan også opnås ved fuldstændig fjernelse af de tidligere deponerede lag af antistoffer og tilpasningen af efterfølgende erhvervede billeder fra andre antistoffer4,5. Disse metoder giver alle pålidelige resultater, selv om hver metode har sine begrænsninger og kræver enten komplicerede procedurer eller et særligt billedbehandlingssystem.
Denne protokol viser anvendelsen af en antistofstrippingmetode ved hjælp af almindeligt tilgængelige buffere. Denne protokol kan bruges til at udføre multiplex immunfluorescerende farvning på formalin-faste paraffin-embedded (FFPE) mus binyresektioner med to umærkede primære antistoffer fra samme værtsart.
Protocol
Representative Results
Discussion
Multiplex immunfarvning er nyttigt at undersøge cellulære colokalisering af to eller flere antigener. Denne udbredte teknik giver overbevisende colokalisering resultater, når primære antistoffer er konjugeret med forskellige journalister (direkte farvning). Men direkte farvning giver normalt svagere signaler i forhold til indirekte farvning, som indebærer konjugerede sekundære antistoffer til at opdage de primære antistoffer. Ved indirekte farvning afhænger et multiximmunfarvningsresultat af høj kvalitet af høj…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde understøttes af NIH R00 HD032636.
Materials
| Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Biotinylated donkey anti-mouse | JacksonImmuno | 715-066-151 | 1:500 dilution |
| Biotinylated donkey anti-rabbit | JacksonImmuno | 711-066-152 | 1:500 dilution |
| DAPI | BioLegend | 422801 | 2 μg/mL in distilled water |
| Fluorescence microscope | ECHO | Revolve 4 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin | JacksonImmuno | 016-030-084 | 1:1000 dilution |
| Microwave oven, 700W | General Electric | JEM3072DH1BB | |
| Mouse anti-CYP2F2 | Santa Cruz, | SC-374540 | 1:250 dilution |
| Mouse anti-TH | Santa Cruz, | SC-25269 | 1:1000 dilution |
| Normal donkey serum | JacksonImmuno | 017-000-121 | 2% serum in PBST |
| Rabbit anti-20αHSD | Kerafast, | EB4002 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-3βHSD | TransGenic, | KO607 | 1:250 dilution |
| Rabbit anti-TH | NOVUS, | NB300-109 | 1:1000 dilution |
| Rabbit anti-β-catenin | Abcam, | ab32572 | 1:500 dilution |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP) | JacksonImmuno | 016-303-084 | 1:1000 dilution |
| TSA Cy3 Tyramide | PerkinElmer | SAT704B001EA | 1:100 dilution |
| TSA Fluorescein Tyramide | PerkinElmer | SAT701001EA | 1:100 dilution |
Riferimenti
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).
- Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies. Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).
- Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization. PLoS One. 7 (2), e32043 (2012).
- Bolognesi, M. M., et al. Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification. Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).
- Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype. Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).
- Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
- Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry. Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).
- Wang, H., Pevsner, J. Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology. Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).
