Microwaving e Fluorophore-Tyramide per l'immunostainizzazione multiplex sulle intendire del mouse - Utilizzo di anticorpi primari non conformi della stessa specie ospite
Summary
Sono stati stabiliti diversi metodi per l’immunostaining multiplex utilizzando anticorpi primari della stessa specie ospite. Qui, descriviamo l’uso di anticorpi mediati a microonde e di fluoroforo-tiramide per bloccare la reattività incrociata dell’anticorpo durante l’immunostaining multiplex su sezioni adrenali del topo con paraffina fissata in formalina.
Abstract
L’immunostazione è ampiamente utilizzata nella ricerca biomedica per mostrare il modello di espressione cellulare di una data proteina. L’immunostaining multiplex consente l’etichettatura utilizzando più anticorpi primari. Per ridurre al minimo la reattività incrociata degli anticorpi, l’immunostaining multiplex che utilizza la colorazione indiretta richiede anticorpi primari senza etichetta provenienti da diverse specie ospiti. Tuttavia, la combinazione appropriata di diversi anticorpi di specie non è sempre disponibile. Qui, descriviamo un metodo di utilizzo di anticorpi primari non etichettati provenienti dalla stessa specie ospite (ad esempio, in questo caso entrambi gli anticorpi provengono dal coniglio) per l’immunofluorescenza multiplex sulle sezioni surrenali con paraffina fissata a formalina (FFPE). Questo metodo utilizza la stessa procedura e reagenti utilizzati nella fase di recupero dell’antigene per rimuovere l’attività del complesso anticorpale primario precedentemente macchiato. I vetrini sono stati macchiati con il primo anticorpo primario utilizzando un protocollo di immunostaining generale seguito da un passo di legame con un anticorpo secondario biotinylato. Poi, un metodo di sviluppo del segnale avidina-biotina-perossidasi è stato utilizzato con fluoroforo-tiramide come substrato. L’immunoattività del primo complesso di anticorpi primari è stata ridotta attraverso l’immersione in una soluzione di citrato di sodio bollente a microonde per 8 min. La deposizione insolubile fluoroforo-tiramide è rimasta sul campione, il che ha permesso di colorare la diapositiva con altri anticorpi primari. Anche se questo metodo elimina la maggior parte dei segnali falsi positivi, alcuni sfondi da anticorpo reattività incrociata può rimanere. Se i campioni sono arricchiti con biotina endogena, un anticorpo secondario coniugato perossidia può essere utilizzato per sostituire l’anticorpo secondario biotinylato per evitare il falso positivo dalla biotina endogena recuperata.
Introduction
Nell’immunostaining multiplex, la colorazione diretta che utilizza anticorpi primari coniugati può fornire risultati informativi. Senza l’uso di anticorpi secondari, il metodo di colorazione diretta ha un basso rischio di falsi segnali di co-localizzazione da reattività incrociata degli anticorpi. Tuttavia, i reporter coniugati (fluoroforo, enzimi) o biotina sull’anticorpo primario ne limitano l’uso futuro. In alternativa, l’immunostaining indiretto di solito fornisce segnali più forti utilizzando un anticorpo primario non coniugato con un anticorpo secondario etichettato. Idealmente, gli anticorpi primari non coniugati utilizzati nell’immunostaining multiplex dovrebbero provenire da diverse specie ospiti per evitare la reattività incrociata degli anticorpi. Tuttavia, l’appropriata combinazione di anticorpi primari di diverse specie ospiti non è sempre disponibile.
Sono stati stabiliti diversi metodi per eliminare il rischio che l’anticorpo secondario reagisca con un anticorpo primario indesiderato. Un metodo comune è l’uso di un anticorpo monomerico F(ab) per bloccare eventuali epitopi leganti rimanenti sul primo complesso anticorpo primario prima della colorazione con il secondo anticorpo primario1. Lo stripping anticorpale, che è simile alla striscia e resonera di un foglio di macchia occidentale, rimuove il complesso anticorpale precedentemente macchiato senza spogliare la deposizione di molecole di reporter rilevabili come 3,3′-diaminobenzidine tetraidrocloruro (DAB)2 e la deposizione di tyramide fluorescente3 . Con questo metodo, le molecole reporter in colori diversi possono mostrare un risultato multiplex sulla stessa diapositiva. La colorazione multiplex è anche realizzabile con la completa rimozione degli strati precedentemente depositati di anticorpi e l’allineamento di immagini successivamente acquisite da altri anticorpi4,5. Tutti questi metodi danno risultati affidabili, anche se ogni metodo ha i suoi limiti e richiede procedure complicate o un sistema di imaging speciale.
Il presente protocollo mostra l’applicazione di un metodo di rimozione degli anticorpi con l’uso di buffer comunemente disponibili. Questo protocollo può essere utilizzato per eseguire una colorazione multiplex immunofluorescente su sezioni surrenali con paraffina fissata in forma di forma (FFPE) con due anticorpi primari non etichettati della stessa specie ospite.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’immunostaining multiplex è utile per esaminare la co-localizzazione cellulare di due o più antigeni. Questa tecnica ampiamente utilizzata fornisce risultati convincenti di co-localizzazione quando gli anticorpi primari sono coniugati con diversi reporter (colorazione diretta). Tuttavia, la colorazione diretta di solito fornisce segnali più deboli rispetto alla colorazione indiretta, che coinvolge anticorpi secondari coniugati per rilevare gli anticorpi primari. Nella colorazione indiretta, un risultato immunostainin…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato da NIH R00 HD032636.
Materials
| Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Biotinylated donkey anti-mouse | JacksonImmuno | 715-066-151 | 1:500 dilution |
| Biotinylated donkey anti-rabbit | JacksonImmuno | 711-066-152 | 1:500 dilution |
| DAPI | BioLegend | 422801 | 2 μg/mL in distilled water |
| Fluorescence microscope | ECHO | Revolve 4 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin | JacksonImmuno | 016-030-084 | 1:1000 dilution |
| Microwave oven, 700W | General Electric | JEM3072DH1BB | |
| Mouse anti-CYP2F2 | Santa Cruz, | SC-374540 | 1:250 dilution |
| Mouse anti-TH | Santa Cruz, | SC-25269 | 1:1000 dilution |
| Normal donkey serum | JacksonImmuno | 017-000-121 | 2% serum in PBST |
| Rabbit anti-20αHSD | Kerafast, | EB4002 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-3βHSD | TransGenic, | KO607 | 1:250 dilution |
| Rabbit anti-TH | NOVUS, | NB300-109 | 1:1000 dilution |
| Rabbit anti-β-catenin | Abcam, | ab32572 | 1:500 dilution |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP) | JacksonImmuno | 016-303-084 | 1:1000 dilution |
| TSA Cy3 Tyramide | PerkinElmer | SAT704B001EA | 1:100 dilution |
| TSA Fluorescein Tyramide | PerkinElmer | SAT701001EA | 1:100 dilution |
Riferimenti
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