Questo protocollo illustra i metodi per consentire una coltura estesa in vitro di xenoinnesti derivati dal paziente (PDX). Un passo migliora la vitalità complessiva delle colture di cluster multicellulari negli idrogel 3D, attraverso la semplice rimozione di singole cellule non vitali. Un passaggio secondario illustra le procedure consigliate per le impostazioni cultura PDX in una piattaforma microfluidica perfusa.
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Articolo metodologico
Maggiore vitalità per le colture di idrogel 3D ex vivo di xenoinnesti derivati dal paziente in una piattaforma microfluidica perfusa
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli xenoinnesti derivati dal paziente (PDX), generati quando il tessuto tumorale del paziente reinsediato viene innestato direttamente in topi immunocompromessi, rimangono biologicamente stabili, preservando così le caratteristiche molecolari, genetiche e istologiche, nonché l'eterogeneità del tumore originale. Tuttavia, l'uso di questi modelli per eseguire una moltitudine di esperimenti, incluso lo screening farmacologico, è proibitivo sia in termini di costi che di tempo. I sistemi di coltura tridimensionali (3D) sono ampiamente visti come piattaforme in cui le cellule tumorali mantengono la loro integrità biologica attraverso interazioni biochimiche, morfologia e architettura. Il nostro team ha una vasta esperienza nella coltivazione di cellule PDX in vitro utilizzando matrici 3D composte da acido ialuronico (HA). Al fine di separare le cellule stromali dei fibroblasti di topo associate ai PDX, usiamo la coltura di rotazione, dove le cellule stromali aderiscono alla superficie delle placche trattate con coltura tissutale mentre le cellule tumorali PDX dissociate galleggiano e si associano in ammassi multicellulari. Fluttuanti anche nel supernatante sono singole, spesso cellule morte, che presentano una sfida nella raccolta di cluster PDX vitali per l'incapsulamento a valle in idrogel per la coltura cellulare 3D. Per separare queste singole cellule dagli ammassi di cellule vive, abbiamo impiegato la centrifugazione gradiente del passo di densità. Il protocollo qui descritto consente l'esaurimento di singole cellule non vitali dalla popolazione sana di cluster cellulari che saranno utilizzati per ulteriori sperimentazioni in vitro. Nei nostri studi, incorporiamo le colture 3D in piastre microfluidiche che consentono la perfusione dei supporti durante la coltura. Dopo aver valutato le colture risultanti utilizzando un saggio di vitalità fluorescente basato su immagini di cellule purificate rispetto a quelle non purificate, i nostri risultati mostrano che questo ulteriore passaggio di separazione ha ridotto sostanzialmente il numero di cellule non vitali dalle nostre colture.
Introduzione
Nell'ultimo decennio, il campo della ricerca sul cancro ha dimostrato un rinnovato entusiasmo per gli xenoinnesti derivati dal paziente (PDX) come strumento per valutare la dipendenza dal percorso delle cellule tumorali e la suscettibilità ai farmaci1. I modelli PDX più comuni sono stabiliti dall'impianto sottocutaneo o ortotopico delle cellule tumorali umane - un frammento tumorale, un ammasso di cellule dissociate derivate dal tumore o un campione di cellule tumorali circolanti isolate (CTC) - in un ospite di roditori. Se il tumore "take" ha successo, le cellule xenograft proliferano, vascolarizzano e altrimenti interagiscono con il tessuto o....
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Protocollo
Il tessuto tumorale è stato ottenuto con il consenso del paziente e secondo un protocollo approvato dell'Institutional Review Board (IRB). Gli xenografti sono stati impiantati, coltivati e raccolti secondo un protocollo accettato institutional animal care and use committee (IACUC).
NOTA: Tutto il lavoro deve essere eseguito in un armadio di sicurezza biologico sterile per mantenere la sterilità. Tutti i passaggi devono essere condotti a temperatura ambiente, salvo diversa indicazione.
1. Preparazione dei materiali per la lavorazione PDX
- Impugnatura autoclave e manico bisturi o lamette da barba.
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Risultati
Un rocker perfusione programmabile è stato preparato in un incubatore standard di coltura cellulare jackato ad acqua e piastre microfluidiche a due corsie sono state preparate in un armadio standard di biosicurezza per il carico(figura 1). Un tumore PDX MDA-PCA-118b è stato espanso in vivo, raccolto quando aveva raggiunto una dimensione massima e dissociato come descritto nella sezione 2 del protocollo per creare una sospensione liquama delle cellule, a circa uno stato a singola cellula (
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Discussione
Qui descriviamo un metodo per elaborare e coltivare cellule tumorali vitali derivate da PDX in un sistema di coltura 3D ad alta produttività e perfuso. Mentre questo protocollo utilizza tessuto PCa PDX, è ugualmente efficace per altri tumori derivati epiteliali. Le caratteristiche tumorali variano tra le singole linee PDX anche all'interno dello stesso tessuto di origine (prostata, seno, ecc.). Alcune linee PCa PDX sono più fibrotiche e difficili da isolare le cellule vitali mentre altre sono più cellulari. La dimensione.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health National Cancer Institute SBIR Phase I (HHSN26120700015C) e P01CA098912.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1N NaOH | qualsiasi grado di coltura tissutale adatto Piastre | ||
| per coltura tissutale rotonde da 60 mm | qualsiasi | ||
| coltura tissutale a 6 pozzetti | qualsiasi | ||
| 70 & micro adatto; Filtri cellulari Corning | 431751 | o equivalente | |
| Centrifuga | Eppendorf | 5810R con rotore e secchi adatti per provette da centrifuga coniche da 15/50 mL | o equivalente |
| Soluzione di centrifugazione a gradiente di densità | Millipore Sigma | P1644 | Percoll |
| Dimetilsolfossido | qualsiasi grado di coltura tissutale adatto | ||
| Soluzione enzimatica di dissociazione | StemCell Technologies | 07921 | ACCUMAX |
| DMEM-F12 | ThermoFisher Scientific 11039021 | o equivalente | |
| Pinze | qualsiasi | ||
| kit di idrogel HA | ESI BIO | GS311 | HyStem (acido ialuronico-SH e PEGDA) |
| Hanks Soluzione salina bilanciata | Lonza | 10-527F | o equivalente |
| Inattivato termicamente siero fetale bovino | Biologicals | S11150 | |
| Emocitometro | Fisher Scientific | 02-671-51B Hausser BrightLine | o equivalente |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H1398 | o |
| equivalente Software di elaborazione delle immagini | Oxford Instruments | Imaris 9.3 | o |
| equivalente Kit di vitalità/citotossicità delle cellule VIVE/MORTE (Calcein-AM/ Ethidium Homodimer-1) | ThermoFisher Scientific | L3224 | o equivalente |
| Piastra di coltura microfluidica | Mimetas | 9603-400-B | Microscopio OrganoPlate a 2 corsie |
| Nikon | A1R | o | |
| equivalente Pipetta multicanale | Eppendorf | 3125000036 | o |
| equivalente Tessuto | tumorale derivato da PDXottenuto in base all'approvazione IRB per i tessuti umani e all'approvazione IACUC per l'ospite animale | ||
| Penicillina-streptomicina | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | o |
| equivalente Rocker di perfusione | Mimetas | OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | |
| strisce di pH (pH 5-9) | qualsiasi | ||
| soluzione salina tamponata con fosfato | Lonza | 17-516F | o equivalente |
| Lamette da | qualsiasi adatto | ||
| Agitatore rotante xy | VWR | Advanced 3500 Agitatore orbitale | o equivalente |
| Manico | qualsiasi pipetta ripetuta | ||
| a canale singolo | Eppendorf | 22260201 | |
| Sterile, 15mL provette | qualsiasi Sterile idonea | ||
| , 50mL provette coniche da centrifuga | qualsiasi adatto |
Riferimenti
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V.
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Ristampe e permessi
