बेसिलस एंथ्रेसिस और अन्य एनकैप्सुलेटेड रोगजनकों के खिलाफ वैक्सीन विकास में कार्यात्मक एंटीबॉडी का मूल्यांकन करने के लिए ऑप्सोनो-पालन परख
Summary
ऑप्सोनो-पालन परख टीका विकास में एंटीबॉडी के ऑपसोनिक कार्यों का मूल्यांकन करने के लिए ऑप्सोनो-फैगोसाइटिक हत्या परख के लिए एक वैकल्पिक तरीका है।
Abstract
ओपोनो-पालन परख एक कार्यात्मक परख है जो पेशेवर फैगोसाइट्स के लिए बैक्टीरियल रोगजनकों के लगाव की गणना करती है। क्योंकि अनुवर्ती phagocytosis और हत्या के लिए अपेक्षित है, परख opsono-phagocytic हत्या परख के लिए एक वैकल्पिक तरीका है । ऑप्सोनो-पालन परख का एक लाभ निष्क्रिय रोगजनकों और स्तनधारी सेल लाइनों का उपयोग करने का विकल्प है, जो कई प्रयोगों में मानकीकरण की अनुमति देता है। परख में एक निष्क्रिय रोगजनक का उपयोग जैवसेफ्टी स्तर 3 संक्रामक एजेंटों और अन्य उग्र रोगजनकों के साथ काम करने की सुविधा भी प्रदान करता है। हमारे काम में, ऑप्सोनो-पालन परख का उपयोग एंटीबॉडी की कार्यात्मक क्षमता का आकलन करने के लिए किया गया था, एक एंथ्रेक्स कैप्सूल आधारित वैक्सीन के साथ प्रतिरक्षित जानवरों के सेरा से, एक माउस मैक्रोफेज सेल लाइन, रॉ 264.7 के लिए निश्चित बैसिलस एंथ्रेसिस के पालन को प्रेरित करने के लिए। मैक्रोफेज का पालन करने वाले बैसिली की छवियों को कैप्चर करने के लिए स्वचालित फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया गया था। सीरम में एंटी-कैप्सूल एंटीबॉडी की उपस्थिति के साथ वृद्धि का पालन सहसंबद्ध किया गया था। गैर-मानव वानरों ने उच्च सीरम एंटी-कैप्सूल एंटीबॉडी सांद्रता का प्रदर्शन किया, एंथ्रेक्स चुनौती से संरक्षित थे। इस प्रकार, ऑप्सोनो-पालन परख का उपयोग सेरा में एंटीजन विशिष्ट एंटीबॉडी के जैविक कार्यों को स्पष्ट करने, वैक्सीन उम्मीदवारों और अन्य चिकित्सीय चिकित्सा की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने और प्रतिरक्षा के संभावित सहसंबद्ध के रूप में सेवा करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
एक रोगजनक की मान्यता, पालन, आंतरिककरण और क्षरण फैगोसाइटोसिस1का अभिन्न अंग है, जो मेजबान जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एक प्रमुख मार्ग है जो पहले 18832, 3में इलिया मेचनिकोफ द्वारा वर्णित है। फागोसाइटिक ल्यूकोसाइट्स, साथ ही प्रतिरक्षा प्रणाली की अन्य कोशिकाएं, लक्ष्यों के चयन में अत्यधिक भेदभावपूर्ण हैं; वे पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (पीआरआरएस)4,5के अपने प्रदर्शनों की सूची द्वारा रोगजनक संबद्ध आणविक पैटर्न के माध्यम से “संक्रामक गैर-स्व” और “गैर-संक्रामक स्वयं” के बीच अंतर करने में सक्षम हैं । एक रोगजनक की मेजबान मान्यता भी मेजबान ओपसोनिन के बाध्यकारी के साथ हो सकती है, जैसे पूरक और एंटीबॉडी6। इस प्रक्रिया, opsonization कहा जाता है, इन अणुओं के साथ रोगजनक कोट, opsonic रिसेप्टर्स (जैसे, पूरक और एफसी रिसेप्टर्स) के लिए बाध्यकारी पर आंतरिककरण बढ़ाने6। एक रोगजनक के लिए एक फागोसिट का पालन करने के लिए, उनके कॉग्नेट लिगांड के साथ कई रिसेप्टर्स का सामूहिक बाध्यकारी आवश्यक है। तभी आंतरिककरण शुरू करने के लिए मेजबान कोशिका के अंदर सिग्नलिंग कैस्केड को ट्रिगर और बनाए रखसकतेहैं ।
रोगजनकों की मंजूरी और संक्रमण की रोकथाम में फैगोसाइटोसिस के महत्व के कारण, बाह्य रोगजनकों ने अपने अस्तित्व को लम्बा करने के लिए इस प्रक्रिया को विकृत करने के कई तरीके विकसित किए हैं। महत्व की एक रणनीति एनियोनिक पॉलीमेरिक (जैसे, पॉलीसैकराइड या पॉलीमिनो एसिड) कैप्सूल का उत्पादन है जो इसके आवेश के आधार पर एंटी-फैगोसाइटिक है, खराब इम्यूनोजेनिक है, और पीआरआरएस6,7से बैक्टीरियल लिफाफे पर अणुओं को ढाल देता है। क्रिप्टोकोकस नियोफॉर्मेंस और स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया जैसे रोगजनकों में सैकराइड पॉलिमर से बने कैप्सूल होते हैं, जबकि स्टेफिलोकोकस एपिडर्मिडिस और कुछ बैसिलस प्रजातियां पॉली-ɣ-ग्लूटामिक एसिड (पीजीजीए)7,8का उत्पादन करती हैं। फिर भी अन्य रोगजनक कैप्सूल का उत्पादन करते हैं जो गैर-संक्रामक स्वयं के समान होते हैं। उदाहरण के लिए, स्ट्रेप्टोकोकस पायोजीन और बी सेरियस के रोगजनक तनाव में एक हायलूरोनिक एसिड कैप्सूल होता है जो न केवल एंटी-फैगोसाइटिक होता है बल्कि जिसे प्रतिरक्षा प्रणाली9,10द्वारा विदेशी के रूप में भी मान्यता नहीं दी जा सकती है।
कैप्सूल का वाहक प्रोटीन के लिए संाधीनता उन्हें गरीब, टी-स्वतंत्र एंटीजन से अत्यधिक इम्यूनोजेनिक टी-निर्भर एंटीजन में परिवर्तित करती है जो उच्च सीरम एंटी-कैप्सूल एंटीबॉडी टाइटर्स11,12को प्रेरित कर सकती है। यह रणनीति एस निमोनिया, हीमोफिलस इन्फ्लूएंजाऔर नेसेरिया मेनिंगिटाइड्स11के खिलाफ लाइसेंस प्राप्त टीकों के लिए कार्यरत है । एंटी-कैप्सूल एंटीबॉडी की ओपसोनिक गतिविधियों का मूल्यांकन आमतौर पर ओपसोनो-फैगोसाइटिक किलिंग परख(ओपीकेए)13, 14,15,16द्वारा किया गया है। ये परखते हैं कि क्या कार्यात्मक एंटीबॉडी फैगोसाइटोसिस को ट्रिगर कर सकते हैं और14की हत्या कर सकते हैं। हालांकि, बी एंथ्रेस 17सहित टियर 1 बायोलॉजिकल सेलेक्ट एजेंट्स एंड टॉक्सिन्स (बीएसएटी) जैसे संक्रामक रोगजनकों के साथ ओपीकेए का उपयोग खतरनाक है और सुरक्षा जोखिम प्रस्तुत करता है; इन परख एक चुनिंदा एजेंट की व्यापक हैंडलिंग की आवश्यकता है। चुनिंदा एजेंट हैंडलिंग केवल प्रतिबंधित जैवसेफ्टी स्तर 3 (बीएसएल-3) प्रयोगशालाओं में किया जा सकता है; इन क्षेत्रों में काम कई सुरक्षा और सुरक्षा सावधानियों के कारण लंबी परिचालन प्रक्रियाओं की मांग करता है जिनका पालन किया जाना चाहिए। बीएसएल-3 प्रयोगशालाएं भी आमतौर पर ओपीकेए के काम के लिए उपयोग किए जाने वाले विशेष उपकरणों से सुसज्जित नहीं होती हैं, जैसे माइक्रोस्कोप और साइटोमीटर। इस प्रकार, हमने निष्क्रिय बैक्टीरिया18 , 19के उपयोग के आधार पर एक वैकल्पिक परख विकसित की । हम इसे एक ऑप्सोनो-पालन परख (ओएए) के रूप में संदर्भित करते हैं जो आंतरिककरण और परख आउटपुट के रूप में हत्या पर निर्भर नहीं है; इसके बजाय, अफीम निष्क्रिय रोगजनकों का पालन फागोसिटोसिस के सूचकांक के रूप में उपयोग किया जाता है। मशीनी रूप से, ओएए एक उपयुक्त विकल्प है क्योंकि पालन एक प्राथमिकताओं होता है और आंतरिककरण और इंट्रासेलुलर हत्या के साथ घनिष्ठ रूप से जुड़ा हुआ है। जैव रक्षा के नजरिए से, ओएए को प्राथमिकता दी जाती है क्योंकि इसके लिए संक्रामक एजेंट की न्यूनतम हैंडलिंग की आवश्यकता होती है, प्रयोगात्मक रूप से ओपीकेए की तुलना में कम अवधि की होती है, और निष्क्रिय रोगजनक के स्टॉक का उत्पादन और स्थानांतरित होने के बाद बीएसएल-2 प्रयोगशालाओं में किया जा सकता है।
हम गैर-मानव वानरों (एनएचपीएस) के सेरा में पाए जाने वाले एंटी-कैप्सूल एंटीबॉडी के ओपसोनिक फ़ंक्शन की जांच करने के लिए ओएए के उपयोग को प्रदर्शित करते हैं, जो एक कैप्सूल संयुग के साथ टीका लगाया जाता है [यानी पीजीजीए बी एंथ्रैसिस से एनिसिया मेनिंगिटाइड्सके बाहरी झिल्ली प्रोटीन परिसर (ओएमपीसी) में संयुग्मित किया जाताहै ] 20। सीरम ओपोनाइज्ड बेसिली को एक अनुयायी माउस मैक्रोफेज सेल लाइन, रॉ 264.7 के साथ इनक्यूबेटेड किया गया था। निर्धारण के बाद, सेल मोनोलेयर और अनुयायी बेसिली को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित किया गया था। जब बेसिल को सीरम20को नियंत्रित करने की तुलना में कैप्सूल संयोजित कैप्सूल के साथ टीका लगाया गया था , तब बैक्टीरियल पालन में वृद्धि हुई . एंथ्रेक्स चैलेंज20 , 21के अस्तित्व के साथ पालन सहसंबद्ध । इस प्रकार, ओएए के उपयोग ने एंटी-कैप्सूल एंटीबॉडी के कार्य की विशेषता है और हमारे वैक्सीन उम्मीदवार के परीक्षण में बहुत सुविधा प्रदान की है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कैप्सूल आधारित टीकों को कई जीवाणु रोगजनकों के खिलाफ प्रभावोत्पादक दिखाया गया है, और कई को मनुष्यों में उपयोग के लिए लाइसेंस प्राप्त है25,26,27। ये टीके कैप्सूल को लक्षि?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
जे चुआ, डी चैबोट और ए फ्रीलैंडर ने पांडुलिपि में वर्णित प्रक्रियाओं को डिजाइन किया। जे चुआ और टी पुटमोन-टेलर ने प्रयोगों का प्रदर्शन किया । डी चैबोट ने डेटा विश्लेषण किया। जे चुआ ने पांडुलिपि लिखी थी ।
लेखक उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए केली जे फिट्स का शुक्रिया अदा करते हैं ।
काम रक्षा खतरा न्यूनीकरण एजेंसी अनुदान सीबीएम द्वारा समर्थित था । VAXBT.03.10.RD.015, योजना संख्या 921175.
राय, व्याख्याओं, निष्कर्ष और सिफारिशों लेखकों के उन है और जरूरी अमेरिकी सेना द्वारा समर्थन नहीं कर रहे हैं । इस प्रकाशन की सामग्री जरूरी विचारों या रक्षा विभाग की नीतियों को प्रतिबिंबित नहीं करता है, और न ही व्यापार के नाम, वाणिज्यिक उत्पादों, या संगठनों का उल्लेख करता है अमेरिकी सरकार द्वारा समर्थन मतलब है ।
Materials
| 0.20 µm syringe filter (25mm, regenerated cellulose) | Corning, Corning, NY | 431222 | |
| 10 mL syringe (Luer-Lok tip) | BD, Franklin Lakes, NJ | 302995 | |
| 15µ 96 well black plates (plate #1 for imaging) | In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA | P96-1-N | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 15710 | |
| 75 cm sq. tissue culture treated flask | Corning, Corning, NY | 430641 | |
| Agar (powder) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Baby Rabbit Complement | Cedarlane Labs, Burlington, NC | CL3441 | |
| Bacto Yeast Extract | BD, Sparks, MD | 288620 | |
| BBL Brain Heart Infusion (BHI) | BD, Sparks, MD | 211059 | |
| Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates | Remel, Lenexa, KS | R01198 | |
| Cell scraper | Sarstedt, Newton, NC | 83.183 | |
| Costar 96 well cell culture plates (plates #2 & 3 for dilutions) | Corning, Corning, NY | 3596 | |
| Cover glass | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 72200-10 | |
| Difco Nutrient Broth | BD, Sparks, MD | 234000 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 11965-092 | contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope) | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AMAFD1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SH30071.03 | not gamma irradiated, not heat inactivated |
| Fluorescein isothiocyanate | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | F143 | |
| HCS Cell Mask Orange Cell Stain | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | H32713 | |
| hemocytometer (Improved Neubauer) | Hausser Scientific, Horsham, PA | 3900 | |
| India Ink solution | BD, Sparks, MD | 261194 | |
| L- glutamine (200 mM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA | 25030081 | supplement medium with additional 2mM L-glutamine |
| Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope) | Nikon Instruments, Melville, NY | TE2000 | |
| PBS without Calcium or Magnesium | Lonza, Walkersville, MD | 17-516F | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SV30010 | |
| petri dishes (100 x 15 mm) | Falcon, Corning, Durham, NC | 351029 | for agar plates |
| RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47) | ATCC, Manassas, VA | ATCC TIB-71 | |
| Slides | VWR, Radnor, PA | 16004-422 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5761 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8154 | |
| Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope) | Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY | 4109001865956000 |
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