바실러스 탄트라시스 및 기타 캡슐화된 병원균에 대한 백신 개발에서 기능적 항체를 평가하는 Opsono-준수 분석
Summary
opsono-준수 분석법은 백신 개발에서 항체의 opsonic 기능을 평가하기 위한 opsono-phagocytic 살인 분석법에 대한 대안적 방법입니다.
Abstract
opsono 준수 분석법은 전문 식세포에 세균성 병원체의 부착을 열거하는 기능성 분석입니다. 준수는 phagocytosis와 살인에 필수이기 때문에, 분석법은 opsono-phagocytic 살인 분석의 대안 방법입니다. opsono 준수 분석의 장점은 여러 실험에 걸쳐 표준화를 허용하는 불활성화 된 병원체 및 포유류 세포주를 사용하는 옵션입니다. 분석에서 불활성화 된 병원체의 사용은 또한 생물 안전 수준 3 전염성 요원 및 기타 악성 병원균과 함께 작동을 용이하게합니다. 우리의 작업에서, opsono 준수 분석체는 탄저병 캡슐 기지를 둔 백신으로 면역화된 동물의 세라로부터 항체의 기능적 능력을 평가하기 위해 사용되었으며, 고정 된 바실러스 탄트라시스의 부착을 마우스 대식세포 세포주, RAW 264.7로 유도하는 데 사용되었습니다. 자동 형광 현미경 검사는 대식세포에 고부딩하는 바실리의 이미지를 캡처하는 데 사용되었습니다. 증가된 준수는 혈청에 있는 항체 항체의 존재와 상관관계가 있었다. 높은 혈청 항체 항체 농도를 전시한 비인간 영장류는 탄탈병 도전으로부터 보호되었다. 따라서, opsono-준수 분석체는 세라에서 항원 특이적 항체의 생물학적 기능을 해명하고, 백신 후보 및 기타 치료제의 효능을 평가하고, 면역의 가능한 상관관계로서 작용할 수 있다.
Introduction
병원체의 인식, 준수, 내재화 및 분해는 1883년 일리아 메치니코프가 처음 기술한 숙주 인내 면역 반응에서 현저한 통로인식세포증1,3에 필수적이다. 면역 계통의 그밖 세포뿐만 아니라 식세포 백혈구는 표적의 그들의 선택에 있는 높게 차별적입니다; 그들은 패턴 인식 수용체 (PRR)4,5의레퍼토리에 의해 병원균 관련 분자 패턴을 통해 “전염성 비 자기”와 “비 감염성 자아”를 구별 할 수 있습니다. 병원체의 숙주 인식은 또한 보완 및 항체6과같은 숙주 opsonins의 결합으로 발생할 수 있다. opsonization에게 불린 이 프로세스는, phagocytic 세포에 opsonic 수용체 (예를 들면, 보충 및 Fc 수용체)에 결합시 내성을 강화하는 이 분자로 병원체를 코팅합니다6. 병원체가 식세포에 부착하려면, 그들의 cognate 리간드와 다중 수용체의 집단 결합이 필요하다. 그런 다음에야 내산화6을 시작하기 위해 호스트 셀 내부의 신호 캐스케이드를 트리거하고 유지할 수있습니다.
병원균의 허가와 감염 예방에 있는 phagocytosis의 중요성 때문에, 세포외 병원체는 그들의 생존을 연장하기 위하여 이 과정을 전복하는 수많은 쪽을 개발했습니다. 중요도의 한 가지 전략은 음이온 중합체(예를 들어, 다당류 또는 폴리아미노산) 캡슐의 생산으로, 그 전하에 의한 항식세포이며, 면역성이 좋지 않으며, PRRs6,7로부터세균용 봉투에 분자를 보호한다. Cryptococcus neoformans 및 연쇄상 구균 폐렴과 같은 병원체는 사카라이드 폴리머로 구성된 캡슐을 가지고 있는 반면, 황색포도상구균 표피증 및 일부 바실러스 종은 폴리 ɣ 글루타믹 산 (PGGA)7,8을생산한다. 그러나 그밖 병원체는 비 전염성 자기를 닮은 캡슐을 생성합니다. 예를 들어, 연쇄상구균 표겐과 B. 세레우스의 병원성 균주는 항식세포뿐만 아니라 면역계통9,10에의해 외국으로 인식되지 않을 수 있는 히알루론산 캡슐을 갖는다.
캡슐을 운반대 단백질로 유도하여 가난한 T-독립적인 항원에서 높은 혈청 항체 티터를 유도할 수 있는 면역성 T 의존성 항원으로 변환한다11,12. 이 전략은 S. 폐렴, 혈우병 인플루엔자, 니세리아 수막기티드11에대한 허가된 백신에 사용된다. 항체의 opsonic 활동은 일반적으로 opsono-phagocytic 살인 분석서(OPKA)13,14,15,16에의해 평가되었다. 이러한 작용성 항체가 식세포증을 유발하고14명을죽일 수 있는지 여부를 테스트합니다. 그러나, B. 탄트라시스17을포함하여 Tier 1 생물학 선택 에이전트 및 독소 (BSAT)와 같은 전염성 병원체를 가진 OPKA의 사용은 위험하고 보안 위험을 제시합니다; 이러한 에세이는 선택 에이전트의 광범위한 처리가 필요합니다. 선택 에이전트 처리는 제한된 생물 안전 수준 3 (BSL-3) 실험실에서만 수행 할 수 있습니다; 이러한 분야에서의 업무는 따라야 할 수많은 안전 및 보안 예방 조치로 인해 장기간 운영 절차를 요구합니다. BSL-3 실험실은 또한 현미경 및 세포계와 같은 OPKA 작업에 사용되는 특수 장비를 전형적으로 갖추지 않습니다. 따라서, 우리는 불활성화박테리아(18),19의사용에 기초하여 대안적 분석체를 개발하였다. 우리는 이것을 내면화와 살인에 의존하지 않는 opsono 준수 분석 (OAA)로 지칭합니다. 대신, 편화불활성 병원균의 준수는 식세포증의 지수로 사용된다. 기계적으로, OAA는 준수가 선견자를 발생하고 내재화 및 세포 내 살인과 밀접하게 얽혀 있기 때문에 적합한 대체품입니다. 생물안전적 관점에서, OAA는 전염하는 제제의 최소한의 취급이 필요하고, OPKA보다 더 짧은 지속 시간의 실험적이며, 불활성화 된 병원체의 재고가 생산및 옮겨진 후 BSL-2 실험실에서 수행 될 수 있기 때문에 선호된다.
우리는 캡슐 공주게이트로 예방 접종된 비인간 영장류(NHP)의 혈청에서 발견되는 항체의 opsonic 기능을 검사하기 위해 OAA의 활용을 입증한다[즉, B. 탄트라시스로부터 PGGA] 네이세리아 수막의외부 막 단백질 복합체(OMPC)에 공각]20. 혈청 협소화 된 바실리는 부착 된 마우스 대식세포 세포주, RAW 264.7로 배양되었다. 고정 후, 세포 단층 및 부착 된 바실리는 형광 현미경 검사법에 의해 이미지되었다. 세균성 준수는 세균성 준수가 대조군혈청(20)에비해 캡슐 컨쥬게이트로 예방 접종된 NHPs로부터 혈청으로 배양되었을 때 증가하였다. 탄집 도전20,21의생존과 상관 관계가 있는 준수. 따라서, OAA의 사용은 항체항체의 기능을 특징으로 하고 백신 후보의 시험을 크게 촉진시켰다.
Protocol
Representative Results
Discussion
캡슐 계 백신은 수많은 세균 성 병원균에 대해 효과적인 것으로 나타났으며, 많은 사람들이 인간25,26,27에서사용하기 위해 허가된다. 이들 백신은 캡슐을 표적으로 하는 항체를 생성함으로써 작용하며 이들 연구의 대부분은 OPKA를 사용하여 항체13,14, 16,<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J. 추아, D. 차봇, A. 프리들랜더는 원고에 설명된 절차를 설계했다. J. 추아와 T. 퍼트몬 테일러는 실험을 수행했다. D. Chabot은 데이터 분석을 수행했습니다. 제이 추아는 원고를 썼다.
저자는 우수한 기술 지원을 카일 J. Fitts 감사합니다.
이 작업은 국방 위협 감소 국 보조금 CBM에 의해 지원되었다. VAXBT.03.10.RD.015, 계획 번호 921175.
의견, 해석, 결론 및 권고사항은 저자의 의견이며 반드시 미 육군의 승인을 받지는 않습니다. 이 출판물의 내용은 반드시 국방부의 견해나 정책을 반영하지 않으며, 무역 이름, 상업용 제품 또는 조직에 대한 언급은 미국 정부의 지지를 의미하지도 않습니다.
Materials
| 0.20 µm syringe filter (25mm, regenerated cellulose) | Corning, Corning, NY | 431222 | |
| 10 mL syringe (Luer-Lok tip) | BD, Franklin Lakes, NJ | 302995 | |
| 15µ 96 well black plates (plate #1 for imaging) | In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA | P96-1-N | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 15710 | |
| 75 cm sq. tissue culture treated flask | Corning, Corning, NY | 430641 | |
| Agar (powder) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Baby Rabbit Complement | Cedarlane Labs, Burlington, NC | CL3441 | |
| Bacto Yeast Extract | BD, Sparks, MD | 288620 | |
| BBL Brain Heart Infusion (BHI) | BD, Sparks, MD | 211059 | |
| Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates | Remel, Lenexa, KS | R01198 | |
| Cell scraper | Sarstedt, Newton, NC | 83.183 | |
| Costar 96 well cell culture plates (plates #2 & 3 for dilutions) | Corning, Corning, NY | 3596 | |
| Cover glass | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 72200-10 | |
| Difco Nutrient Broth | BD, Sparks, MD | 234000 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 11965-092 | contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope) | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AMAFD1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SH30071.03 | not gamma irradiated, not heat inactivated |
| Fluorescein isothiocyanate | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | F143 | |
| HCS Cell Mask Orange Cell Stain | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | H32713 | |
| hemocytometer (Improved Neubauer) | Hausser Scientific, Horsham, PA | 3900 | |
| India Ink solution | BD, Sparks, MD | 261194 | |
| L- glutamine (200 mM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA | 25030081 | supplement medium with additional 2mM L-glutamine |
| Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope) | Nikon Instruments, Melville, NY | TE2000 | |
| PBS without Calcium or Magnesium | Lonza, Walkersville, MD | 17-516F | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SV30010 | |
| petri dishes (100 x 15 mm) | Falcon, Corning, Durham, NC | 351029 | for agar plates |
| RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47) | ATCC, Manassas, VA | ATCC TIB-71 | |
| Slides | VWR, Radnor, PA | 16004-422 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5761 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8154 | |
| Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope) | Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY | 4109001865956000 |
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