Ensaio opsono-adesão para avaliar anticorpos funcionais no desenvolvimento de vacinas contra bacillus anthracis e outros patógenos encapsulados
Summary
O ensaio opsono-adesão é um método alternativo ao ensaio opsono-fagocítico de matar para avaliar as funções opsônicas dos anticorpos no desenvolvimento de vacinas.
Abstract
O ensaio opsono-adesão é um ensaio funcional que enumera o apego de patógenos bacterianos a fagocitos profissionais. Como a adesão é necessária à fagocitose e à matança, o ensaio é um método alternativo para ensaios de morte opsono-fagocítico. Uma vantagem do ensaio de adesão opsono é a opção de usar patógenos inativados e linhas celulares de mamíferos, o que permite a padronização em vários experimentos. O uso de um patógeno inativado no ensaio também facilita o trabalho com agentes infecciosos de nível 3 de biossegurança e outros patógenos virulentos. Em nosso trabalho, o ensaio opsono-adesão foi utilizado para avaliar a capacidade funcional dos anticorpos, desde soro de animais imunizados com uma vacina à base de cápsula de antraz, para induzir a adesão de Anthracis fixas de Bacillus a uma linha de células macrófagos do camundongo, RAW 264.7. A microscopia automatizada de fluorescência foi usada para capturar imagens de bacilos aderindo a macrófagos. O aumento da adesão foi correlacionado com a presença de anticorpos anti-cápsula no soro. Primatas não humanos que exibiam altas concentrações de anticorpos anti-cápsulas de soro foram protegidos do desafio do antraz. Assim, o ensaio opsono-adesão pode ser utilizado para elucidar as funções biológicas de anticorpos específicos de antígeno no Sera, avaliar a eficácia dos candidatos à vacina e outras terapêuticas, e servir como uma possível correlação de imunidade.
Introduction
Reconhecimento, adesão, internalização e degradação de um patógeno são parte integrante da fagocitose1, um caminho saliente na resposta imune inata hospedeira descrita pela primeira vez por Ilya Metchnikoff em 18832,3. Leucócitos fagocíticos, bem como outras células do sistema imunológico, são altamente discriminatórios em sua seleção de alvos; eles são capazes de distinguir entre “não-eu infeccioso” e “eu não infeccioso” através de padrões moleculares associados ao patógeno por seu repertório de receptores de reconhecimento de padrões (PRRs)4,5. O reconhecimento hospedeiro de um patógeno também pode ocorrer com a vinculação de opsoninas hospedeiras, como complemento e anticorpos6. Esse processo, chamado opsonização, reveste o patógeno com essas moléculas, aumentando a internalização ao vincular-se a receptores opsônicos (por exemplo, receptores complementares e fc) em células fagocíticas6. Para que um patógeno adere a um fagocito, é necessária a ligação coletiva de múltiplos receptores com seus ligantes cognatos. Só então a adesão pode desencadear e sustentar cascatas de sinalização dentro da célula hospedeira para iniciar a internalização6.
Devido à importância da fagocitose no despejo de patógenos e prevenção de infecções, patógenos extracelulares desenvolveram inúmeras formas de subverter esse processo para prolongar sua sobrevivência. Uma estratégia de importância é a produção de uma cápsula polimérica aniônica (por exemplo, polissacarídeo ou poliaminoácido), que é anti-fagocítica em virtude de sua carga, é pouco imunogênica e protege moléculas no envelope bacteriano das PRRs6,7. Patógenos como Cryptococcus neoformans e Streptococcus pneumoniae possuem cápsulas compostas de polímeros sacarídeos, enquanto staphylococcus epidermidis e algumas espécies de Bacillus produzem ácido poli-ɣ-glutamico (PGGA)7,8. No entanto, outros patógenos produzem cápsulas que se assemelham ao eu não infeccioso. Por exemplo, Streptococcus pyogenes e uma cepa patogênica de B. cereus têm uma cápsula de ácido hialurônico que não é apenas anti-fagocítica, mas que também pode não ser reconhecida como estrangeira pelo sistema imunológico9,10.
A conjugação da cápsula para proteínas portadoras converte-os de antígenos pobres e independentes de T em antígenos altamente imunogênicos dependentes de T que podem induzir os anticorpos anti-cápsula de soro elevado11,12. Esta estratégia é empregada para vacinas licenciadas contra S. pneumoniae, Haemophilus influenzaee meningite Neisseria11. As atividades opsônicas de anticorpos anti-cápsula têm sido comumente avaliadas por ensaios de morte opsono-fagocítico (OPKA)13,14,15,16. Estes ensaios testam se anticorpos funcionais podem desencadear fagocitose e matar14. No entanto, o uso de OPKA com patógenos infecciosos, como Agentes e Toxinas Biológicas de Nível 1 (BSAT), incluindo B. anthracis17,é perigoso e apresenta riscos à segurança; esses ensaios exigem um manuseio extensivo de um agente selecionado. O manuseio de agentes selecionados só pode ser feito em laboratórios de biossegurança restrito nível 3 (BSL-3); o trabalho nessas áreas exige procedimentos operacionais prolongados devido às inúmeras precauções de segurança e segurança que devem ser seguidas. Os laboratórios BSL-3 também normalmente não são equipados com os equipamentos especializados utilizados para o trabalho opka, como microscópios e citómetros. Assim, desenvolvemos um ensaio alternativo baseado no uso de bactérias inativadas18,19. Referimo-nos a isso como um ensaio opsono-adesão (OAA) que não depende da internalização e da morte como saídas de ensaio; em vez disso, a adesão de patógenos inativados opsonizados é usada como um índice de fagocitose. Mecanicamente, o OAA é um substituto adequado porque a adesão ocorre a priori e está intimamente entrelaçada com internalização e assassinato intracelular. Do ponto de vista da biossegurança, o OAA é preferido porque requer manuseio mínimo de um agente infeccioso, é experimentalmente de menor duração que o OPKA, e pode ser realizado em laboratórios BSL-2 depois que um estoque do patógeno inativado foi produzido e transferido.
Demonstramos a utilização da OAA para examinar a função opsônica de anticorpos anti-cápsula encontrados em soro de primatas não humanos (NHPs) vacinados com uma cápsula conjugada [ou seja, PGGA de B. antracracis conjugado ao complexo proteico da membrana externa (OMPC) de meningite neisseria]20. Bacilos opssonizados de soro foram incubados com uma linha de células macrófagos de camundongos aderentes, RAW 264.7. Após a fixação, a monocamada celular e bacilos aderentes foram imagens por microscopia de fluorescência. A adesão bacteriana aumentou quando os bacilos foram incubados com soro de NHPs vacinados com o conjugado da cápsula em comparação com o soro de controle20. Adesão correlacionada com a sobrevivência do desafio antraz20,21. Assim, o uso de OAA caracterizou a função de anticorpos anti-cápsula e facilitou muito o teste do nosso candidato à vacina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vacinas à base de cápsulas têm se mostrado eficazes contra numerosos patógenos bacterianos, e muitas são licenciadas para uso em humanos25,26,27. Essas vacinas funcionam gerando anticorpos voltados para a cápsula e muitos desses estudos utilizam o OPKA para mostrar as funções opsono-fagocíticas dos anticorpos13,14,16,</sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J. Chua, D. Chabot e A. Friedlander projetaram os procedimentos descritos no manuscrito. J. Chua e T. Putmon-Taylor realizaram os experimentos. D. Chabot realizou análise de dados. J. Chua escreveu o manuscrito.
Os autores agradecem a Kyle J. Fitts pela excelente assistência técnica.
O trabalho contou com o apoio da Agência de Redução de Ameaças de Defesa da CBM. VAXBT.03.10.RD.015, plano número 921175.
Opiniões, interpretações, conclusões e recomendações são dos autores e não são necessariamente endossadas pelo Exército dos EUA. O conteúdo desta publicação não reflete necessariamente as opiniões ou políticas do Departamento de Defesa, nem menciona nomes comerciais, produtos comerciais ou organizações implicam o endosso do Governo dos EUA.
Materials
| 0.20 µm syringe filter (25mm, regenerated cellulose) | Corning, Corning, NY | 431222 | |
| 10 mL syringe (Luer-Lok tip) | BD, Franklin Lakes, NJ | 302995 | |
| 15µ 96 well black plates (plate #1 for imaging) | In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA | P96-1-N | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 15710 | |
| 75 cm sq. tissue culture treated flask | Corning, Corning, NY | 430641 | |
| Agar (powder) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Baby Rabbit Complement | Cedarlane Labs, Burlington, NC | CL3441 | |
| Bacto Yeast Extract | BD, Sparks, MD | 288620 | |
| BBL Brain Heart Infusion (BHI) | BD, Sparks, MD | 211059 | |
| Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates | Remel, Lenexa, KS | R01198 | |
| Cell scraper | Sarstedt, Newton, NC | 83.183 | |
| Costar 96 well cell culture plates (plates #2 & 3 for dilutions) | Corning, Corning, NY | 3596 | |
| Cover glass | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 72200-10 | |
| Difco Nutrient Broth | BD, Sparks, MD | 234000 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 11965-092 | contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope) | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AMAFD1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SH30071.03 | not gamma irradiated, not heat inactivated |
| Fluorescein isothiocyanate | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | F143 | |
| HCS Cell Mask Orange Cell Stain | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | H32713 | |
| hemocytometer (Improved Neubauer) | Hausser Scientific, Horsham, PA | 3900 | |
| India Ink solution | BD, Sparks, MD | 261194 | |
| L- glutamine (200 mM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA | 25030081 | supplement medium with additional 2mM L-glutamine |
| Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope) | Nikon Instruments, Melville, NY | TE2000 | |
| PBS without Calcium or Magnesium | Lonza, Walkersville, MD | 17-516F | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SV30010 | |
| petri dishes (100 x 15 mm) | Falcon, Corning, Durham, NC | 351029 | for agar plates |
| RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47) | ATCC, Manassas, VA | ATCC TIB-71 | |
| Slides | VWR, Radnor, PA | 16004-422 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5761 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8154 | |
| Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope) | Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY | 4109001865956000 |
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