Opsono-Adherence Assay для оценки функциональных антител в разработке вакцин против bacillus anthracis и других инкапсулированных патогенов
Summary
Анализ опсоно-приверженности является альтернативным методом анализа опсоно-фагоцитического убийства для оценки опсонических функций антител в разработке вакцины.
Abstract
Анализ опсо-приверженности является функциональным анализом, который перечисляет присоединение бактериальных патогенов к профессиональным фагоцитам. Поскольку присоединение является необходимым для фагоцитоза и убийства, анализ является альтернативным методом опсоно-фагоцитического убийства анализы. Преимуществом анализа opsono-присоединения является возможность использования инактивированных патогенов и линий клеток млекопитающих, что позволяет стандартизировать в ходе нескольких экспериментов. Использование инактивированного патогена в анализе также облегчает работу с биобезопасности уровня 3 инфекционных агентов и других опасных патогенов. В нашей работе, анализ соответствия opsono был использован для оценки функциональной способности антител, от серы животных, иммунизированных вакциной на основе капсулы сибирской язвы, чтобы вызвать присоединение фиксированной Bacillus anthracis к линии клеток макрофаг мыши, RAW 264.7. Автоматизированная микроскопия флуоресценции использовалась для захвата изображений бацилл, придерживающихся макрофагов. Повышенная приверженность коррелирует с наличием анти капсульных антител в сыворотке крови. Не-человеческие приматы, которые продемонстрировали высокие концентрации антител в сыворотке крови против капсулы, были защищены от борьбы с сибирской язвой. Таким образом, анализ соответствия опсоно может быть использован для выяснения биологических функций антигенных специфических антител в сыворотке, для оценки эффективности вакцины кандидатов и других терапевтических средств, а также служить в качестве возможного корреляции иммунитета.
Introduction
Признание, приверженность, интернализации и деградации патогена являются неотъемлемойчастью фагоцитоза 1, заметный путь в принимающей врожденный иммунный ответ впервые описан Илья Метчников в 18832,3. Фагоцитные лейкоциты, как и другие клетки иммунной системы, являются весьма дискриминационными в выборе целей; они способны различать “инфекционное не-я” и “неинфекционные самоуправления” через патогенные связанные молекулярные модели их репертуар рецепторов распознавания образов (PRRs)4,5. Распознавание хозяина патогена может также происходить с связыванием опсонинов хозяина, таких как дополнение и антитела6. Этот процесс, называемый опсонизацией, покрывает патоген этими молекулами, усиливая интернализации при связывании с опсоническими рецепторами (например, дополнять и Fc рецепторы) на фагоцитных клетках6. Для того, чтобы возбудитель придерживался фагоцита, необходимо коллективное связывание нескольких рецепторов с их лигандами cognate. Только тогда присоединение может вызвать и поддерживать сигнальные каскады внутри ячейки-хозяина, чтобы инициировать интернализацию6.
В связи с важностью фагоцитоза в очистке патогенных микроорганизмов и профилактике инфекции, внеклеточные патогены разработали множество способов подорвать этот процесс, чтобы продлить их выживание. Одной из стратегий важности является производство анионовой полимерной (например, полисахаридной или полиаминовой кислоты) капсулы, которая является антифагоцитной в силу своего заряда, плохо иммуногенной, и защищает молекулы на бактериальной оболочке от PRRs6,7. Патогенные микроорганизмы, такие как Cryptococcus neoformans и Streptococcus pneumoniae имеют капсулы, состоящие из сахаридных полимеров, в то время как стафилококк эпидермидис и некоторые виды Bacillus производят поли-ɣ-глутамовую кислоту (PGGA)7,8. Тем не менее, другие патогены производят капсулы, которые напоминают неинфекционные самоуправления. Например, стрептококк пиогены и патогенный штамм B. cereus имеют капсулу гиалуроновой кислоты, которая является не только антифагоцитной, но которые также не могут быть признаны иностраннымииммунной системой 9,10.
Спряжение капсулы для носителя белков преобразует их из бедных, T-независимых антигенов в высоко иммуногенных Т-зависимых антигенов, которые могут вызвать высокую сыворотку анти-капсулы антитела титеры11,12. Эта стратегия используется для лицензированных вакцин против S. pneumoniae, Haemophilus influenzae, и Neisseria meningitides11. Опсонные действия анти-капсулы антител, как правило, были оценены опсоно-фагоцитических анализов убийства (OPKA)13,14,15,16. Эти анализы тест ли функциональные антитела могут вызвать фагоцитоз и убийство14. Тем не менее, использование OPKA с инфекционными патогенами, такими как Tier 1 Биологические выберите агентов и токсинов (BSAT), в том числе B. anthracis17, является опасным и представляет угрозу безопасности; эти анализы требуют тщательного обращения с выбранным агентом. Обработка выбора агента может быть выполнена только в лабораториях ограниченного уровня биобезопасности 3 (BSL-3); работа в этих областях требует длительных оперативных процедур в связи с многочисленными мерами предосторожности и безопасности, которые необходимо соблюдать. Лаборатории BSL-3 также, как правило, не оснащены специализированным оборудованием, используемым для работы OPKA, таким как микроскопы и цитометры. Таким образом, мы разработали альтернативный анализ, основанный на использовании инактивированныхбактерий 18,19. Мы называем это анализом о приверженности опсоно (ОАА), который не зависит от интернализации и убийства в результате анализа; вместо этого, соблюдение опсонизированных инактивированных патогенов используется в качестве индекса фагоцитоза. Механистически, OAA является подходящей заменой, потому что соблюдение происходит априори и тесно переплетается с интернализации и внутриклеточного убийства. С точки зрения биобезопасности, ОАА является предпочтительным, поскольку она требует минимальной обработки инфекционного агента, экспериментально короче, чем OPKA, и может быть выполнена в лабораториях BSL-2 после того, как запас инактивированного патогена был произведен и передан.
Мы демонстрируем использование OAA для изучения опсонной функции анти-капсулы антител, найденных в сыворотке не-человеческих приматов (NHPs) вакцинированы с капсулой конъюгировать (т.е. PGGA от B. anthracis спрягается с внешней мембраны белкового комплекса (OMPC) neisseria менингитаNo 20. Сыворотка opsonized бациллы были инкубированы с приверженцем мыши макрофаг клеточной линии, RAW 264.7. После фиксации, монослой клеток и адепт бациллы были изображены с помощью микроскопии флуоресценции. Бактериальное присоединение увеличилось, когда бациллы были инкубированы сывороткой из NHPs вакцинированы капсулы конъюгировать по сравнению с контролемсыворотки 20. Соблюдение коррелирует с выживанием сибирской язвывызов 20,21. Таким образом, использование ОАА характеризовало функцию антител против капсулы и значительно облегчило тестирование нашего кандидата вакцины.
Protocol
Representative Results
Discussion
Капсула на основе вакцин было показано, что эффективно против многочисленных бактериальных патогенов, и многие из них лицензированы дляиспользования в организме человека 25,26,27. Эти вакцины работают путем генерации антител, направленн…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Д. Чуа, Д. Чабот и А. Фридландер разработали процедуры, описанные в рукописи. Эксперименты проводили Дж.Чуа и Т. Путмон-Тейлор. Д. Чабот провел анализ данных. Рукопись написалА Ч. Чуа.
Авторы благодарят Кайл j. Fitts за отличную техническую помощь.
Работа была поддержана агентством по уменьшению оборонной угрозы грантом CBM. VAXBT.03.10.RD.015, план No 921175.
Мнения, толкования, выводы и рекомендации являются мнениями авторов и не обязательно одобрены армией США. Содержание этой публикации не обязательно отражает мнения или политику министерства обороны, равно как и упоминание торговых наименований, коммерческих продуктов или организаций не подразумевает одобрения со стороны правительства США.
Materials
| 0.20 µm syringe filter (25mm, regenerated cellulose) | Corning, Corning, NY | 431222 | |
| 10 mL syringe (Luer-Lok tip) | BD, Franklin Lakes, NJ | 302995 | |
| 15µ 96 well black plates (plate #1 for imaging) | In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA | P96-1-N | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 15710 | |
| 75 cm sq. tissue culture treated flask | Corning, Corning, NY | 430641 | |
| Agar (powder) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Baby Rabbit Complement | Cedarlane Labs, Burlington, NC | CL3441 | |
| Bacto Yeast Extract | BD, Sparks, MD | 288620 | |
| BBL Brain Heart Infusion (BHI) | BD, Sparks, MD | 211059 | |
| Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates | Remel, Lenexa, KS | R01198 | |
| Cell scraper | Sarstedt, Newton, NC | 83.183 | |
| Costar 96 well cell culture plates (plates #2 & 3 for dilutions) | Corning, Corning, NY | 3596 | |
| Cover glass | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 72200-10 | |
| Difco Nutrient Broth | BD, Sparks, MD | 234000 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 11965-092 | contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope) | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AMAFD1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SH30071.03 | not gamma irradiated, not heat inactivated |
| Fluorescein isothiocyanate | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | F143 | |
| HCS Cell Mask Orange Cell Stain | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | H32713 | |
| hemocytometer (Improved Neubauer) | Hausser Scientific, Horsham, PA | 3900 | |
| India Ink solution | BD, Sparks, MD | 261194 | |
| L- glutamine (200 mM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA | 25030081 | supplement medium with additional 2mM L-glutamine |
| Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope) | Nikon Instruments, Melville, NY | TE2000 | |
| PBS without Calcium or Magnesium | Lonza, Walkersville, MD | 17-516F | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SV30010 | |
| petri dishes (100 x 15 mm) | Falcon, Corning, Durham, NC | 351029 | for agar plates |
| RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47) | ATCC, Manassas, VA | ATCC TIB-71 | |
| Slides | VWR, Radnor, PA | 16004-422 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5761 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8154 | |
| Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope) | Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY | 4109001865956000 |
Riferimenti
- Walters, M. N., Papadimitriou, J. M. Phagocytosis: a review. CRC Critical Reviews in Toxicology. 5 (4), 377-421 (1978).
- Metschnikoff, E. Untersuchurgen uber die intracellulare Verdauung, bei wirbellosen Thieren. Arbeiten aus dem Zoologischen Instituten der Universität Wien. 5, 144 (1883).
- Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
- Janeway, C. A. The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunology Today. 13 (1), 11-16 (1992).
- Kumagai, Y., Akira, S. Identification and functions of pattern-recognition receptors. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (5), 985-992 (2010).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annual Review of Pathology. 7, 61-98 (2012).
- Candela, T., Fouet, A. Poly-gamma-glutamate in bacteria. Molecular Microbiology. 60 (5), 1091-1098 (2006).
- Kocianova, S., et al. Key role of poly-gamma-DL-glutamic acid in immune evasion and virulence of Staphylococcus epidermidis. Journal of Clinical Investigation. 115 (3), 688-694 (2005).
- Rothbard, S. Protective effect of hyaluronidase and type-specific anti-M serum on experimental group A Streptococcus infection in mice. Journal of Experimental Medicine. 88 (3), 325-342 (1948).
- Oh, S. Y., Budzik, J. M., Garufi, G., Schneewind, O. Two capsular polysaccharides enable Bacillus cereus G9241 to cause anthrax-like disease. Molecular Microbiology. 80 (2), 455-470 (2011).
- Knuf, M., Kowalzik, F., Kieninger, D. Comparative effects of carrier proteins on vaccine-induced immune response. Vaccine. 29 (31), 4881-4890 (2011).
- Wang, T. T., Lucas, A. H. The capsule of Bacillus anthracis behaves as a thymus-independent type 2 antigen. Infection & Immunity. 72 (9), 5460-5463 (2004).
- Vogel, L., et al. Quantitative flow cytometric analysis of opsonophagocytosis and killing of nonencapsulated Haemophilus influenzae by human polymorphonuclear leukocytes. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1 (4), 394-400 (1994).
- Salehi, S., Hohn, C. M., Penfound, T. A., Dale, J. B. Development of an Opsonophagocytic Killing Assay Using HL-60 Cells for Detection of Functional Antibodies against Streptococcus pyogenes. mSphere. 3 (6), 00617-00618 (2018).
- Wang, Y., et al. Novel Immunoprotective Proteins of Streptococcus pneumoniae Identified by Opsonophagocytosis Killing Screen. Infection & Immunity. 86 (9), (2018).
- Humphries, H. E., et al. Seroprevalence of Antibody-Mediated, Complement-Dependent Opsonophagocytic Activity against Neisseria meningitidis Serogroup B in England. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (5), 503-509 (2015).
- Jansen, W. T., et al. Use of highly encapsulated Streptococcus pneumoniae strains in a flow-cytometric assay for assessment of the phagocytic capacity of serotype-specific antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 5 (5), 703-710 (1998).
- Wang, T. T., Fellows, P. F., Leighton, T. J., Lucas, A. H. Induction of opsonic antibodies to the gamma-D-glutamic acid capsule of Bacillus anthracis by immunization with a synthetic peptide-carrier protein conjugate. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (3), 231-237 (2004).
- Chabot, D. J., et al. Protection of rhesus macaques against inhalational anthrax with a Bacillus anthracis capsule conjugate vaccine. Vaccine. 34 (34), 4012-4016 (2016).
- Chabot, D. J., et al. Efficacy of a capsule conjugate vaccine against inhalational anthrax in rabbits and monkeys. Vaccine. 30 (5), 846-852 (2012).
- Chua, J., et al. Formaldehyde and Glutaraldehyde Inactivation of Bacterial Tier 1 Select Agents in Tissues. Emerging Infectious Diseases. 25 (5), 919-926 (2019).
- . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Eighth Edition) Available from: https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011)
- Durando, P., et al. Experience with pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine (conjugated to CRM197 carrier protein) in children and adults. Clinical Microbiology and Infection. 19, 1-9 (2013).
- Adams, W. G., et al. Decline of childhood Haemophilus influenzae type b (Hib) disease in the Hib vaccine era. JAMA. 269 (2), 221-226 (1993).
- Balmer, P., Borrow, R., Miller, E. Impact of meningococcal C conjugate vaccine in the UK. Journal of Medical Microbiology. 51 (9), 717-722 (2002).
- Chen, M., et al. Induction of opsonophagocytic killing activity with pneumococcal conjugate vaccine in human immunodeficiency virus-infected Ugandan adults. Vaccine. 26 (38), 4962-4968 (2008).
- Paschall, A. V., Middleton, D. R., Avci, F. Y. Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (146), e59400 (2019).
- Ezzell, J. W., Welkos, S. L. The capsule of Bacillus anthracis, a review. Journal of Applied Microbiology. 87 (2), 250 (1999).
- Hanna, P. C., Acosta, D., Collier, R. J. On the role of macrophages in anthrax. Proceedings of the National Academies of Sciences of the United States of America. 90 (21), 10198-10201 (1993).
- Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
- Chua, J., Deretic, V. Mycobacterium tuberculosis reprograms waves of phosphatidylinositol 3-phosphate on phagosomal organelles. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36982-36992 (2004).
- Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infection & Immunity. 85 (1), (2017).
- Ober, R. J., Radu, C. G., Ghetie, V., Ward, E. S. Differences in promiscuity for antibody-FcRn interactions across species: implications for therapeutic antibodies. International Immunology. 13 (12), 1551-1559 (2001).
- Sorman, A., Zhang, L., Ding, Z., Heyman, B. How antibodies use complement to regulate antibody responses. Molecular Immunology. 61 (2), 79-88 (2014).
- Henckaerts, I., Durant, N., De Grave, D., Schuerman, L., Poolman, J. Validation of a routine opsonophagocytosis assay to predict invasive pneumococcal disease efficacy of conjugate vaccine in children. Vaccine. 25 (13), 2518-2527 (2007).
- Wolf, J. J. . Special Considerations for the Nonclinical Safety Assessment of Vaccines. , 243-255 (2013).
