Enkel litografifri encellig mikromönster med laserskurna stenciler
Summary
Detta protokoll introducerar en litografifri mikromönstermetod som är enkel och tillgänglig för dem med en begränsad bioengineering bakgrund. Denna metod använder anpassade laser-cut stenciler till micropattern extracellulära matrisproteiner i en form av intresse för modulerande cell morfoologier. Förfarandet för micropatterning visas med hjälp av inducerad pluripotenta stamceller härledda kardiomyocyter.
Abstract
Mikromönster tekniker har använts i stor utsträckning i cellbiologi för att studera effekterna av att kontrollera cellens form och storlek på cellöden bestämning vid single cell resolution. Nuvarande state-of-the-art encelliga mikromönster tekniker innebär mjuk litografi och mikro-kontakt utskrift, som är en kraftfull teknik, men kräver utbildad teknisk kompetens och vissa anläggning stöd i mikrotillverkning. Dessa begränsningar kräver en mer tillgänglig teknik. Här beskriver vi en enkel alternativ litografifri metod: stencilbaserad encellig mönster. Vi erbjuder steg-för-steg-procedurer inklusive stencildesign, polyakrylamidhydrogeltillverkning, stencilbaserad proteinintegration samt cellplätering och kultur. Denna enkla metod kan användas för att mönstra en matris med så många som 2000 celler. Vi visar mönstring av kardiomyocyter som härrör från enstaka mänskliga inducerad pluripotenta stamceller (hiPSC) med distinkta cellformer, från en 1:1 kvadrat till en 7:1 vuxen cardiomyocyte-liknande rektangel. Denna stencil-baserade encelliga mönster är litografi-fri, tekniskt robust, bekväm, billig, och viktigast av allt tillgänglig för dem med en begränsad bioteknik bakgrund.
Introduction
Tillkomsten av hiPSCs och den efterföljande utvecklingen av protokoll för deras riktade differentiering till olika celltyper har gjort det möjligt att studera utveckling och sjukdom på molekylär och patientspecifik nivå, särskilt med hjälp av patient-härledda iPSC kardiomyocyter (iPSC-CMs) för att modellera kardiomyopatier1,2. En stor begränsning till att studera utveckling och fysiologi med hjälp av iPSC-systemet och andra in vitro-modeller är dock avsaknaden av en strukturerad mikromiljö. På plats utsätts celler för begränsningarna i den extracellulära matrisen (ECM), liksom angränsande celler. Den särskilda biokemiska sammansättningen och styvheten hos dessa mikromiljöer dikterar den rumsliga fördelningen av celler samt faktorer som finns tillgängliga för att delta i cellvidhäftning. Detta påverkar i sin tur intracellulära signalvägar, genuttryck och cellödsbesehet. Till exempel, micropatterned iPSC-CM i en vuxen-liknande stav form har en betydligt bättre kontraktil förmåga, kalcium flöde, mitokondriell organisation, elektrofysiologi, och tvärgående-tubule bildning3. Således är egenskaperna hos mikromiljön integrerade i regleringen av cellulära funktioner.
Tidigare mikromönstertekniker är starkt beroende av fotolitografi (figur 1A). I denna teknik, ett lager av ljuskänslig polymer, eller fotoresist, snurras på ett platt substrat från lösning för att bilda en tunn film ca 1 μm tjock. Därefter appliceras ultraviolett (UV) ljus på fotoresistensen genom en mask som innehåller önskat mönster. Exponering för ultraviolett (UV) ljus förändrar kemiskt fotoresistensen genom att ändra dess löslighet i dess respektive utvecklarlösning och överför önskat mönster från masken till substratet. Många mikromönster metoder innehåller fotolitografi, eftersom det ger nanometer till mikrometer-nivå kontroll över utformningen av cellen mönster. Men spinning av fotoresistens är mycket känslig för föroreningar, eftersom de minsta dammpartiklar kommer att störa spridningen av lösningen i en tunn film. Fotolitografi måste därför utföras i oförorenade anläggningar, som är kostsamma att underhålla och kräver särskild expertis att utnyttja. Dessutom är de kemikalier som används i fotolitografi ofta giftiga för celler och kan denaturera viktiga biomolekyler. Således utgör fotolitografi betydande hinder för tillverkning av mikromönster för bekväma biologiska tillämpningar.
År 1994 övervann Whitesides och kollegor4 några av de utmaningar som förknippas med fotolitografi genom att bana väg för en samling tekniker som kallas mjuk litografi. I mjuk litografi används en mikrostrukturerad yta gjord med polydimetylsiloxan (PDMS), ett transparent, gummiliknande material, för att generera ett mönster av ECM-proteiner4. Vanliga mjuka litografiska tekniker inkluderar mikrokontakt utskrift och mikrofluidiska mönster. Vid mikrokontaktstryck, för närvarande den mest populära mjuka litografiska metoden, överför en PDMS-stämpel belagd med ECM-proteiner materialet till en yta vid de områden som kontaktas av stämpeln (figur 1B). I mikrofluidiska mönster är mikrostrukturer utformade på en PDMS-yta så att när stämpeln pressas till ett substrat skapas ett nätverk av mikrokanaler, genom vilket vätskor kan levereras till önskade områden (figur 1C)5. Mjuk litografi erbjuder flera fördelar jämfört med fotolitografi. När en huvudrån är mikrofabricerad kan PDMS-stämplarna enkelt replikeras utan ytterligare anställning av renrumsfaciliteter. Dessutom möjliggör frånvaron av organiska lösningsmedel i processen för mjuk litografi för användning av polymera material som polystyren, som vanligtvis används i cellodling. Slutligen är mikromönster med mjuka litografiska metoder inte begränsad till plana ytor. Således ökar mjuk litografi tillgängligheten och funktionaliteten hos mikromönster tillverkning över fotolitografi6. Men mjuk litografi har betydande nackdelar. Till exempel krävs fortfarande ett första etsningssteg, med hjälp av fotolitografi, för att mikrofabritera stämpeln. Dessutom är mikromönster med hjälp av en PDMS-stämpel föremål för variationer i kvaliteten på proteinöverföringen till substratet6. Undvika dessa avvikelser kräver optimering och konsekvens i trycket tillämpas på PDMS stämpel under proteinöverföring, annars deformation och snedvridning av funktionen storlekar pdms formar kan uppstå6. Det finns också en stor oro för att upprepade gånger använda PDMS på grund av liten molekylabsorption7.
För att undvika att använda mjuk fotolitografi och PDMS-frimärken beskriver vi en stencilbaserad litografifri mikromönstermetod med en cell som övervinner många av de hinder som är förknippade med fotolitografi och mjuk litografi. I denna metod används en polyakrylamidhydrogel som substrat för stencilbaserad ECM-proteinbildning, vilket möjliggör selektiv plätering av enskilda hiPSC-CMs. Denna teknik är mycket kompatibel med polymera material som används i klassiska cellodlingsförhållanden. Dessutom, med korrekt rengöring och underhåll, stencilerna är återanvändbara och resistenta mot nedbrytning och proteinabsorption under mikrotillverkningsprocessen. Slutligen är mönstringsprocessen tekniskt robust, billig, anpassningsbar och tillgänglig för dem som inte har några specialiserade bioengineering färdigheter. Denna stencil-baserade mikromönster teknik har i stort sett utnyttjats i våra senaste publikationer modellering olika kardiomyopatier8,9,10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en litografifri stencilbaserad mikromönstermetod som möjliggör effektiv mönstring av vidhäftande celler. I detta protokoll visar vi mönstring av hiPSC-CMs i olika längd-till-bredd nyckeltal av micropatterning källaren membran matris protein öar på polyacrylamide hydrogels med fysiologiskt- eller patologiskt relevanta vävnad stelheter eller kisel-baserade elastomer substrat. Denna metod är relativt enkel och mycket tillgänglig för alla forskare, inklusive de som har liten bakgrund inom fotolitog…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av postdoktorala stipendium från Stanford Child Health Research Institute (CHRI) och National Institute of Health (1F32HL1422205-01) till S.L, Director’s Pioneer Award (LM012179-03), American Heart Association Established Investigator Award (17EIA33410923), Stanford Cardiovascular Institute, Hoffmann och Schroepfer Foundation och Stanford Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine till S.M.W , utmärkelser från National Institute of Health (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) och tobaksrelaterat sjukdomsforskningsprogram (TRDRP 27IR-0012) till J.C.W, American Heart Association (AHA) Postdoc Fellowship Award (18POST34030106) till H.Y och Hengstberger-stipendiet till TS. Vi tackar Dr Andrew Olsen från Stanford Neuroscience Microscopy Service på stöd av konfokal avbildning av micropatterned hiPSC-CM. Vi tackar H.Y. för första stencil design, tillverkning, single cell micropatterning av iPSC-CM på polyacrylamide hydrogel belagda coverslip, och preliminära confocal imaging av sarkomerstrukturen av encelliga micropatterned iPSC-CMs.
Materials
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder) | Sigma-Aldrich | 516155 | |
| Acrylamide solution 40% (solution) | Sigma-Aldrich | A-4058-100mL | |
| Bench UV lamp 365 nm | UVP | UVP 95-0042-07, XX-15L | |
| BioFlex culture plate | FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC | 6-well plate with silicon elastomer substrate | |
| Bis-acrylamide solution 2% (solution) | Sigma-Aldrich | M1533-25mL | |
| Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm | Sigma | CLS285522 | |
| Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder) | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | basement membrane matrix protein solution |
| Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics | Acros Organics | 326881000 | |
| Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane | Millipore | SLGV013SL | |
| Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm) | Fisher Scientific | SCGP00525 | |
| Stencils | Potomac | custom design | |
| Sulfo-SANPAH | ThermoFisher Scientific | 22589 | |
| TrypLE Select 10x | ThermoFisher Scientific | A1217702 | Enzyme used for stencil cleaning |
Riferimenti
- Burridge, P. W., et al. Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science. Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).
- Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers. Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).
- Toepke, M. W., Beebe, D. J. PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications. Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).
- Seeger, T., et al. A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
- Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
- Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
- Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues. Biomaterials. 202, 26-34 (2019).
- Théry, M., Pépin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment. Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).
- Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).
