Prøveudtagning og analyse af animal scent signaler
Summary
Vi har udviklet en effektiv metode til prøveudtagning og analyse af lugtsignaler for at forstå, hvordan de kan bruges i dyrekommunikation. Især bruger vi headspace solid-fase mikroextraction kombineret med gaskromatografi-masse spektrometri til at analysere de flygtige komponenter af dyrelugt og duft-markeringer.
Abstract
Vi har udviklet en effektiv metode til prøveudtagning og analyse af lugtsignaler ved hjælp af headspace solid-phase microextraction kombineret med gaskromatografi-massespektrometri for at forstå, hvordan de kan anvendes i dyrekommunikation. Denne teknik gør det muligt at foretage en halvkantitativ analyse af de flygtige komponenter i lugtsekretioner ved at gøre det muligt at udskille og foreløbig identifikation af komponenterne i prøven efterfulgt af analysen af forholdet mellem spidsbelastningsområde og at lede efter tendenser, der kan betyde forbindelser, der kan være involveret i signalering. De vigtigste styrker ved denne aktuelle tilgang er det udvalg af stikprøvetyper, der kan analyseres. manglende behov for et komplekst prøvepræparat eller -ekstraktion evnen til at adskille og analysere komponenterne i en blanding; identifikation af de konstaterede komponenter og evnen til at levere semi-kvantitative og potentielt kvantitative oplysninger om de fundne komponenter. Den væsentligste begrænsning af metoden vedrører selve stikprøverne. Da komponenter af særlig interesse er flygtige, og disse let kan gå tabt, eller deres koncentrationer ændres, er det vigtigt, at prøverne opbevares og transporteres korrekt efter indsamlingen. Det betyder også, at opbevarings- og transportforholdene for stikprøver er relativt dyre. Denne metode kan anvendes på en række prøver (herunder urin, afføring, hår og duft-kirtel lugt sekreter). Disse lugte består af komplekse blandinger, der forekommer i en række matricer, og kræver derfor brug af teknikker til at adskille de enkelte komponenter og udtrække forbindelser af biologisk interesse.
Introduction
Der vides meget lidt om de kemiske ændringer , der understøtter de olfaktoriske signaler hos dyr1, også på grund af metodologiske udfordringer med at registrere og kvantificere flygtige kemiske profiler af lugt2. Der er flere potentielle faldgruber, når man arbejder med meget komplekse, kemiske matricer; disse omfatter ved prøveudtagning og analyse aflugtprøverne 3.
På Rosalind Franklin Science Center, University of Wolverhampton, er vi i gang med en analyse af lugt og duft-mærker til at forstå, hvordan de kan bruges af dyr. Vi kombinerer semiokemisteri med adfærdsmæssig økologi, endokrinologi og cytologi for at forbedre vores forståelse af den rolle, som olfaktoriske signaler spiller i dyrekommunikation.
Vi har udviklet en metode og derefter analyseret lugte og markeringer fra en række arter, herunder flere ikke-menneskelige primater (dvs. kronede lemurer, rød-ruffed lemurer, japanske makakaber, oliven bavianer, chimpanser) og andre pattedyr (dvs. katte, køer). Vi har indsamlet og analyseret en række prøver, herunder urin, afføring, hår og duft-kirtel lugt sekreter. Disse lugte og duftmærker består af komplekse blandinger af forbindelser, og derfor skal enhver metode, der anvendes til deres analyse, omfatte en form for separateringsteknik. Som illustreret forekommer de også i en række matricer, som kræver brug af teknikker til at udtrække de komponenter af interesse.
Tidligere undersøgelser foretaget af Vaglio et al.4 og andre forfattere5 anvendte dynamisk headspaceekstraktion (DHS) med gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS), mens der også er anvendt direkte solventekstraktion6 og komplekse solventekstraktioner7. Især indebærer dynamisk headspace-prøvetagning, at hovedrummet renses med en kendt mængde inert gas, som i sidste ende fjerner alle flygtige forbindelser med undtagelse af dem, der viser en stærk affinitet for prøvematrixen (f.eks. polære forbindelser i vandige prøver).
For den nuværende metode har vi vedtaget teknikken med headspace solid-phase microextraction (HS-SPME) kombineret med GC-MS. Vi har især udviklet og forbedret den metode, der allerede blev anvendt af Vaglio et al. i det tidligere GC-MS-laboratorium8,9,10.
Solventless ekstraktion teknikker er meget effektive til at analysere små, meget flygtige forbindelser (som ellers kan gå tabt let fra en prøve), fordi disse metoder immobilisere forbindelser på en stabil, solid fase støtte. HS-SPME bruger en fiber belagt med en adsorbent polymer til at fange flygtige forbindelser i prøvens headspace eller til at udtrække opløste forbindelser ved nedsænkning i en vandig biologisk væske11. Polymerbelægningen binder ikke forbindelserne kraftigt, derfor kan de fjernes ved opvarmning i GC’ens injektionsport. Denne metode er mere kraftfuld end solventekstraktionsteknikker og også mere effektiv end DHS.
I den nuværende metode er prøverne indeholdt i glasflasker. Disse hætteglas opvarmes til en temperatur på 40 °C for at simulere dyrets kropstemperatur for at fremme de flygtige komponenter i duftmærket for at besætte hætteglassets hovedrum. En SPME-fiber, belagt med 65 μm polydimethylsiloxan/divinylbenzen (PDMS/DVB) sorbentmateriale, udsættes for headspacemiljøet, og flygtige komponenter fra prøven adsorberes på fiberen. Ved opvarmning af fiberen i indløbsporten på en GC-MS desorberes de flygtige komponenter fra fiberen og adskilles derefter af GC. Der opnås massespektralfragmenteringsmønstre for hver komponent, der anvender MS. Ved sammenligning af disse massespektre mod massespektrale databaser kan det være muligt forsøgsvis at identificere komponenterne i duftmærket. Gennem brug af en auto-sampler, er vi i stand til at analysere flere prøver i partier på en ensartet måde.
I betragtning af at hver type SPME fiber har en anden affinitet med polære kemikalier, er fiberen normalt vælges afhængigt af polaritet og / eller molekylvægt af målet kemiske forbindelser. Derudover ændres GC-betingelserne afhængigt af typen af GC-kolonne og egenskaberne ved de målkemiske forbindelser.
Denne teknik gør det muligt at foretage en halvkantitativ analyse af de flygtige komponenter i duftmarkeringer ved at muliggøre adskillelse og foreløbig identifikation af komponenterne i prøven efterfulgt af en analyse af forholdet mellem spidsbelastningsområde for at se efter tendenser, der kan betyde komponenter i duftmærkningen, der kan være involveret i signalering.
De vigtigste styrker ved denne nuværende tilgang er:
- Det interval af eksempeltyper, der kan analyseres.
- Der kræves ingen kompleks prøveforberedelse eller -ekstraktion.
- Evnen til at analysere flygtige komponenter.
- Evnen til at adskille komponenterne i en blanding.
- At være i stand til at identificere de fundne komponenter.
- Evnen til at give semi-kvantitative og potentielt kvantitative oplysninger om de fundne komponenter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Brugen af kontrolprøver, både miljøkontroller, der blev oprettet på tidspunktet for prøveindsamlingen, og systemdiske emner er afgørende for fortolkningen af duftmærkeprøverne. Eventuelle toppe, der tilskrives prøvetagningsmiljøet eller instrumentsystemet, skal udelukkes fra duftmærkeprøver, således at kun de højeste af interesse indgår i enhver fortolkning. Disse kontroller kan også spille en rolle i vurderingen og overvågningen af instrumenteringens “sundhed”.
Protokollen in…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Keith Holding for hans hjælp med kemiske analyser på Rosalind Franklin Science Center, Wolverhampton, og Ben Mantle for produktionen af videoen. Vi er også taknemmelige for professor Gloriano Moneti, Dr. Giuseppe Pieraccini og medlemmerne af Universitetet i Firenzes Mass Spectrometry Center, Firenze, og for prof. Luca Calamai og Dr. Marco Michelozzi fra CNR’s ARCA Lab, Firenze, for deres hjælp til at oprette denne metode. De forskningsprojekter, der omfattede de prøveudtagnings- og analysemetoder, der er beskrevet i manuskriptet, blev støttet af to Marie Skłodowska-Curie Intra European Fellowships (Grant Agreement IDs: 327083, 703611), et lille tilskud (‘Den sensoriske berigede primat‘) fra Primate Society of Britain og et lille forskningstilskud (‘Har jæger-samlere en særlig lugtesans?‘) fra British Academy / The Leverhulme Trust til S.V. Laboratoriearbejdet, der var nødvendigt for at oprette denne metode, modtog også finansiering fra Det Naturvidenskabelige Fakultets årlige finansieringskonkurrence (Wolverhampton) til S.V.
Materials
| 10 mL autosampler vials | Agilent | 5188-5392 | 10 ml screwtop vials with |
| 18 mm vial caps | Agilent | 8010-0139 | Magnetic with PTFE/silicone septa |
| Autosampler | Agilent | GC120 PAL autosampler | |
| Capillary column | Agilent | HP5-MS | 30 m x 0.25 mm; 0.25 µm |
| Data analysis software | Agilent | – | ChemStation |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890B | |
| Inlet septa | Agilent | 5182-3442 | Merlin microseal |
| Mass Selective Detector | Agilent | 5977A | |
| Reporting software | Microsoft | – | Excel |
| Spectral library | NIST | – | NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library |
| Spectral library search program | NIST | – | MS Search v.2.2 |
| Splitless Inlet liner | Agilent | 5190-4048 | |
| SPME fibres | Agilent | SU57345U | 65 µm PDMS/DVB fibre |
Riferimenti
- Wyatt, T. D. . Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , (2014).
- Heymann, E. W. The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution. American Journal of Primatology. 68 (6), 519-524 (2006).
- Drea, C. M., Boulet, M., DelBarco-Trillo, J. The “secret” in secretions: Methodological considerations in deciphering primate olfactory communication. American Journal of Primatology. 75 (7), 621-642 (2013).
- Vaglio, S., et al. Sternal gland scent-marking signals sex, age, rank and group identity in captive mandrills. Chemical Senses. 41 (2), 177-186 (2016).
- Marneweck, C., Jürgens, A., Shrader, A. M. Dung odours signal sex, age, territorial and oestrous state in white rhinos. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 284 (1846), (2016).
- Shear, W. A., Jones, T. H., Miras, H. M. A possible phylogenetic signal in milliped chemical defenses. Biochemical Systematics and Ecology. 35, 838-842 (2007).
- Kimura, R. Volatile substances in feces, urine and urine-marked feces of feral horses. Canadian Journal of Animal Science. 81 (3), 411-420 (2001).
- Vaglio, S., Minicozzi, P., Bonometti, E., Mello, G., Chiarelli, B. Volatile signals during pregnancy: a possible chemical basis for mother-infant recognition. Journal of Chemical Ecology. 35 (1), 131-139 (2009).
- Setchell, J. M., et al. Chemical composition of scent-gland secretions in an Old World monkey (Mandrillus sphinx): influence of sex, male status, and individual identity. Chemical Senses. 35 (3), 205-220 (2010).
- Setchell, J. M., et al. Odour signals MHC genotype in an Old World monkey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 278 (1703), 274-280 (2011).
- Pawliszyn, J. . Solid phase microextraction: theory and practice. , (1997).
- Janda, E. D., Perry, K., Hankinson, E., Walker, D., Vaglio, S. Sex differences in scent-marking in captive red-ruffed lemurs. American Journal of Primatology. 81 (1), 22951 (2019).
