Campionamento e analisi dei segnali di profumo animale
Summary
Abbiamo sviluppato una metodologia efficace per il campionamento e l’analisi dei segnali di odore al fine di capire come possono essere utilizzati nella comunicazione animale. In particolare, utilizziamo la microesezione a fase solida headspace abbinata alla spettrometria gascromatografia-massa per analizzare i componenti volatili degli odori animali e dei segni olfatto.
Abstract
Abbiamo sviluppato una metodologia efficace per il campionamento e l’analisi dei segnali di odore, utilizzando la microesezione in fase solida headspace accoppiata alla spettrometria gascromatografia-massa, per capire come possono essere utilizzati nella comunicazione animale. Questa tecnica consente l’analisi semi-quantitativa dei componenti volatili delle secrezioni di odori consentendo la separazione e l’identificazione provvisoria dei componenti nel campione, seguita dall’analisi dei rapporti di area di picco per cercare tendenze che potrebbero significare composti che possono essere coinvolti nella segnalazione. I punti di forza chiave di questo approccio attuale sono la gamma di tipi di campioni che possono essere analizzati; la mancanza di necessità di preparazione o estrazione di campioni complessi; la capacità di separare e analizzare i componenti di una miscela; l’identificazione dei componenti rilevati; e la capacità di fornire informazioni semi-quantitative e potenzialmente quantitative sui componenti rilevati. La limitazione principale alla metodologia riguarda i campioni stessi. Poiché i componenti di interesse specifico sono volatili, e questi potrebbero facilmente andare perduti, o le loro concentrazioni modificate, è importante che i campioni siano immagazzinati e trasportati in modo appropriato dopo la loro raccolta. Ciò significa anche che le condizioni di stoccaggio e trasporto dei campioni sono relativamente costose. Questo metodo può essere applicato a una varietà di campioni (tra cui urina, feci, capelli e secrezioni di odori di ghiandola profumata). Questi odori consistono in miscele complesse, che si verificano in una serie di matrici, e quindi richiedono l’uso di tecniche per separare i singoli componenti ed estrarre i composti di interesse biologico.
Introduction
Si sa molto poco dei cambiamenti chimici alla base dei segnali olfattivi negli animali1,anche a causa delle sfide metodologiche nella registrazione e quantificazione dei profili chimici volatili degli odori2. Ci sono diverse potenziali insidie quando si lavora con matrici chimiche altamente complesse; questi includono durante il campionamento e l’analisi dei campioni di odore3.
Al Rosalind Franklin Science Center, Università di Wolverhampton, stiamo intraprendendo l’analisi di odori e segni di profumo per capire come possono essere utilizzati dagli animali. Combiniamo la semiochimica con l’ecologia comportamentale, l’endocrinologia e la citologia per migliorare la nostra comprensione del ruolo svolto dai segnali olfattivi nella comunicazione animale.
Abbiamo sviluppato una metodologia e poi analizzato odori e marcature di una varietà di specie tra cui diversi primati non umani (cioè lemuri coronati, lemuri arruffati di rosso, macachi giapponesi, babbuini d’oliva, scimpanzé) e altri mammiferi (ad esempio gatti, mucche). Abbiamo raccolto e analizzato una varietà di campioni, tra cui urina, feci, capelli e secrezioni di odori di ghiandola profumata. Questi odori e segni di profumo consistono in miscele complesse di composti e quindi qualsiasi metodologia utilizzata per la loro analisi deve includere una qualche forma di tecnica separatoria. Come illustrato, si verificano anche in una serie di matrici che richiedono l’uso di tecniche per estrarre i componenti di interesse.
Studi precedenti di Vaglio et al. In particolare, il campionamento dinamico dello spazio di testa comporta l’eliminazione dello spazio della testa con un volume noto di gas inerte che alla fine rimuove tutti i composti volatili ad eccezione di quelli che mostrano una forte affinità per la matrice del campione (ad esempio, composti polari in campioni acquosi).
Per l’attuale metodologia, abbiamo adottato la tecnica della microesezione in fase solida headspace (HS-SPME) abbinata a GC-MS. In particolare, abbiamo sviluppato e migliorato la metodologia già utilizzata da Vaglioet al.
Le tecniche di estrazione senza solventi sono molto efficaci per analizzare composti piccoli e altamente volatili (che altrimenti possono essere persi facilmente da un campione) perché questi metodi immobilizzano i composti su un supporto di fase stabile e solido. L’HS-SPME utilizza una fibra rivestita con un polimero adsorbente per catturare composti volatili nello spazio della testa del campione o per estrarre composti disciolti per immersione in un fluido biologico acquoso11. Il rivestimento polimerico non lega fortemente i composti, quindi riscaldando nella porta di iniezione del GC possono essere rimossi. Questo metodo è più potente delle tecniche di estrazione dei solventi e anche più efficace del DHS.
Nell’approccio corrente i campioni sono contenuti all’interno di fiale di vetro. Queste fiale vengono riscaldate a una temperatura di 40 °C per simulare la temperatura corporea animale al fine di promuovere i componenti volatili del marchio di profumo per occupare lo spazio della testa del flaconcino. Una fibra SPME, rivestita con 65 μm di polidimetilsiloxano/divinilbenzene (PDMS/DVB) materiale assorbente, è esposta all’ambiente dello spazio della testa e i componenti volatili del campione vengono adsorbiti sulla fibra. Al riscaldamento della fibra nella porta di ingresso di un GC-MS, i componenti volatili vengono desorbiti dalla fibra e quindi separati dal GC. I modelli di frammentazione spettrale di massa sono ottenuti per ogni componente utilizzando la SM. Rispetto a questi spettri di massa rispetto ai database spettrali di massa, può essere possibile identificare provvisoriamente i componenti del marchio di profumo. Attraverso l’uso di un campionatore automatico, siamo in grado di analizzare più campioni in lotti in modo coerente.
Dato che ogni tipo di fibra SPME ha una diversa affinità con le sostanze chimiche polari, la fibra viene solitamente scelta a seconda della polarità e/o del peso molecolare dei composti chimici bersaglio. Inoltre, le condizioni gc vengono modificate a seconda del tipo di colonna GC e delle caratteristiche dei composti chimici bersaglio.
Questa tecnica consente l’analisi semi-quantitativa dei componenti volatili delle marcature olmografiche consentendo la separazione e l’identificazione provvisoria dei componenti nel campione, seguita dall’analisi dei rapporti di area di picco per cercare tendenze che potrebbero significare componenti della marcatura del profumo che possono essere coinvolte nella segnalazione.
I principali punti di forza di questo approccio attuale sono:
- Intervallo di tipi di campione che possono essere analizzati.
- Non sono richieste complesse preparazione o estrazioni del campione.
- La capacità di analizzare componenti volatili.
- La capacità di separare i componenti di una miscela.
- Per essere in grado di identificare i componenti rilevati.
- La capacità di fornire informazioni semi-quantitative e potenzialmente quantitative sui componenti rilevati.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’uso di campioni di controllo, sia controlli ambientali creati al momento della raccolta dei campioni che spazi vuoti del sistema, sono fondamentali per l’interpretazione dei campioni di marchio di profumo. Tutti i picchi attribuiti all’ambiente di campionamento o al sistema strumentale devono essere esclusi dai campioni di marchio di profumo in modo che solo i picchi di interesse siano inclusi in qualsiasi interpretazione. Questi controlli possono anche svolgere un ruolo nella valutazione e nel monitoraggio dello “stat…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Keith Holding per la sua assistenza alle analisi chimiche presso il Rosalind Franklin Science Center, Wolverhampton e Ben Mantle per la produzione del video. Siamo inoltre grati al Prof. Gloriano Moneti, al Dott. Giuseppe Pieraccini e ai membri del Mass Spectrometry Center dell’Università di Firenze, Firenze, e al Prof. Luca Calamai e al Dott. Marco Michelozzi dell’ARCA Lab del CNR di Firenze, per il loro aiuto nella messa a punto di questa metodologia. I progetti di ricerca che comprendevano i metodi di campionamento e di analisi descritti nel manoscritto sono stati sostenuti da due Borse intraeuropee Marie Skłodowska-Curie (ID accordo di sovvenzione: 327083, 703611), una piccola sovvenzione (‘Il primate arricchito sensoriale‘) della Primate Society of Great Britain, e una piccola borsa di ricerca (‘I cacciatori-raccoglitori hanno uno speciale senso dell’olfatto?‘) dalla British Academy/The Leverhulme Trust a S.V. Il lavoro di laboratorio necessario per impostare questa metodologia ha anche ricevuto finanziamenti dal Concorso annuale di finanziamento della Facoltà di Scienze e Ingegneria (Wolverhampton) a S.V.
Materials
| 10 mL autosampler vials | Agilent | 5188-5392 | 10 ml screwtop vials with |
| 18 mm vial caps | Agilent | 8010-0139 | Magnetic with PTFE/silicone septa |
| Autosampler | Agilent | GC120 PAL autosampler | |
| Capillary column | Agilent | HP5-MS | 30 m x 0.25 mm; 0.25 µm |
| Data analysis software | Agilent | – | ChemStation |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890B | |
| Inlet septa | Agilent | 5182-3442 | Merlin microseal |
| Mass Selective Detector | Agilent | 5977A | |
| Reporting software | Microsoft | – | Excel |
| Spectral library | NIST | – | NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library |
| Spectral library search program | NIST | – | MS Search v.2.2 |
| Splitless Inlet liner | Agilent | 5190-4048 | |
| SPME fibres | Agilent | SU57345U | 65 µm PDMS/DVB fibre |
Riferimenti
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