Amostragem e Análise de Sinais de Aroma Animal
Summary
Desenvolvemos uma metodologia eficaz para amostragem e análise de sinais de odor, a fim de entender como eles podem ser usados na comunicação animal. Particularmente, usamos microextração de fase sólida do headspace, juntamente com espectrometria de massa cromatografia gasosa para analisar os componentes voláteis de odores animais e marcas de odor.
Abstract
Desenvolvemos uma metodologia eficaz para amostragem e análise de sinais de odor, utilizando microextração em fase sólida do headspace, juntamente com espectrometria de massa cromatografia gasosa, para entender como eles podem ser usados na comunicação animal. Esta técnica permite a análise semi-quantitativa dos componentes voláteis das secreções do odor, permitindo a separação e a identificação provisória dos componentes na amostra, seguida pela análise das razões de pico de área para procurar tendências que possam significar compostos que possam estar envolvidos na sinalização. Os principais pontos fortes dessa abordagem atual são a gama de tipos de amostra que podem ser analisados; a falta de necessidade de qualquer preparação ou extração de amostras complexas; a capacidade de separar e analisar os componentes de uma mistura; a identificação dos componentes detectados; e a capacidade de fornecer informações semi-quantitativas e potencialmente quantitativas sobre os componentes detectados. A principal limitação à metodologia diz respeito às próprias amostras. Uma vez que os componentes de interesse específico são voláteis, e estes poderiam facilmente ser perdidos, ou suas concentrações alteradas, é importante que as amostras sejam armazenadas e transportadas adequadamente após sua coleta. Isso também significa que as condições de armazenamento e transporte de amostras são relativamente caras. Este método pode ser aplicado a uma variedade de amostras (incluindo urina, fezes, secreções de odor de cabelo e odor de glândulas odor). Esses odores consistem em misturas complexas, ocorrendo em uma variedade de matrizes, e, portanto, necessitam do uso de técnicas para separar os componentes individuais e extrair os compostos de interesse biológico.
Introduction
Muito pouco se sabe sobre as mudanças químicas que sustentam os sinais olfativos nos animais1, também por causa dos desafios metodológicos no registro e quantificação de perfis químicos voláteis de odores2. Existem várias armadilhas potenciais quando se trabalha com matrizes químicas altamente complexas; estes incluem na amostragem e análise das amostras de odor3.
No Centro de Ciências Rosalind Franklin, Universidade de Wolverhampton, estamos realizando a análise de odores e marcas de cheiro para entender como eles podem ser usados por animais. Combinamos semioquímica com ecologia comportamental, endocrinologia e citologia para melhorar nossa compreensão do papel desempenhado pelos sinais olfativos na comunicação animal.
Desenvolvemos uma metodologia e, em seguida, analisamos odores e marcas de uma variedade de espécies, incluindo vários primatas não humanos (ou seja, lêmures coroados, lêmures-vermelhos, macaques japoneses, babuínos de oliva, chimpanzés) e outros mamíferos (ou seja, gatos, vacas). Coletamos e analisamos uma variedade de amostras, incluindo urina, fezes, secreções de odor de cabelo e odor de glândulas odor. Estes odores e marcas de odor consistem em misturas complexas de compostos e, portanto, qualquer metodologia utilizada para sua análise precisa incluir alguma forma de técnica separada. Como ilustrado, também ocorrem em uma gama de matrizes que necessitam do uso de técnicas para extrair os componentes de interesse.
Estudos anteriores de Vaglio et al.4 e outros autores5 utilizaram extração dinâmica do headspace (DHS) com espectrometria de massa cromatografia gasosa (GC-MS), enquanto a extração direta de solventes6 e extrações complexas de solventes7 também foram utilizadas. Particularmente, a amostragem dinâmica do headspace envolve a eliminação do espaço para a cabeça com um volume conhecido de gás inerte que, em última análise, remove todos os compostos voláteis, com exceção daqueles que mostram uma forte afinidade com a matriz amostral (por exemplo, compostos polares em amostras aquosas).
Para a metodologia atual, adotamos a técnica de microextração em fase sólida do headspace (HS-SPME) aliada ao GC-MS. Em particular, desenvolvemos e aprimoraram a metodologia já utilizada por Vaglio et al. em seu laboratório anterior GC-MS8,9,10.
As técnicas de extração sem solvente são muito eficazes para analisar compostos pequenos e altamente voláteis (que de outra forma podem ser perdidos facilmente de uma amostra) porque esses métodos imobilizam compostos em um suporte de fase estável e sólido. O HS-SPME usa uma fibra revestida com um polímero adsorbente para capturar compostos voláteis no headspace da amostra ou para extrair compostos dissolvidos por imersão em um fluido biológico aquoso11. O revestimento de polímero não liga fortemente os compostos, portanto, pelo aquecimento na porta de injeção do GC eles podem ser removidos. Este método é mais poderoso do que as técnicas de extração de solventes e também mais eficaz que o DHS.
Na abordagem atual, as amostras estão contidas dentro de frascos de vidro. Estes frascos são aquecidos a uma temperatura de 40 °C para simular a temperatura do corpo animal, a fim de promover os componentes voláteis da marca do perfume para ocupar o espaço da cabeça do frasco. Uma fibra SPME, revestida com 65 μm de material sorbente de polidimtilsiloxano/divinylbenzene (PDMS/DVB), é exposta ao ambiente do headspace e componentes voláteis da amostra são adsorvidos na fibra. Ao aquecer a fibra na porta de entrada de um GC-MS, os componentes voláteis são desordenados da fibra e, em seguida, separados pelo GC. Padrões de fragmentação espectral em massa são obtidos para cada componente usando o MS. Comparando esses espectros de massa com bancos de dados espectrais em massa, pode ser possível identificar provisoriamente os componentes da marca do perfume. Através do uso de um amostrador automático, podemos analisar várias amostras em lotes de forma consistente.
Dado que cada tipo de fibra SPME tem uma afinidade diferente com produtos químicos polares, a fibra geralmente é escolhida dependendo da polaridade e/ou peso molecular dos compostos químicos alvo. Além disso, as condições de GC são alteradas dependendo do tipo de coluna GC e das características dos compostos químicos alvo.
Esta técnica permite a análise semi-quantitativa dos componentes voláteis das marcas de odor, permitindo a separação e a identificação provisória dos componentes da amostra, seguida pela análise das razões de pico de área para procurar tendências que possam significar componentes da marcação do odor que possam estar envolvidos na sinalização.
Os principais pontos fortes desta abordagem atual são:
- A gama de tipos de amostra que podem ser analisados.
- Não são necessárias preparações ou extrações complexas da amostra.
- A capacidade de analisar componentes voláteis.
- A capacidade de separar os componentes de uma mistura.
- Para ser capaz de identificar os componentes detectados.
- A capacidade de fornecer informações semi-quantitativas e potencialmente quantitativas sobre os componentes detectados.
Protocol
Representative Results
Discussion
O uso de amostras de controle, ambos os controles ambientais criados no momento da coleta de amostras e espaços em branco do sistema, são cruciais para a interpretação das amostras de marca de odor. Quaisquer picos atribuídos ao ambiente amostral ou ao sistema instrumental precisam ser excluídos das amostras de marcas de odor para que apenas os picos de interesse sejam incluídos em qualquer interpretação. Esses controles também podem desempenhar um papel na avaliação e monitoramento da “saúde” da instrumenta…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Keith Holding por sua ajuda com análises químicas no Rosalind Franklin Science Center, Wolverhampton, e Ben Mantle pela produção do vídeo. Também somos gratos ao Prof. Gloriano Moneti, ao Dr. Giuseppe Pieraccini e aos membros do Centro de Espectrometria de Massa da Universidade de Florença, Florença, e ao Prof. Luca Calamai e ao Dr. Marco Michelozzi do Laboratório ARCA da CNR, Florença, por sua ajuda na criação dessa metodologia. Os projetos de pesquisa que incluíram os métodos de amostragem e análise descritos no manuscrito foram apoiados por duas Bolsas Intra Europeias Marie Skłodowska-Curie (IDs do Grant Agreement: 327083, 703611), uma pequena bolsa (‘O primata enriquecido sensorial‘) da Sociedade Primata da Grã-Bretanha, e uma pequena bolsa de pesquisa (‘Caçadores-coletores têm um senso especial de olfato?‘) da Academia Britânica/The Leverhulme Trust para S.V. O trabalho de laboratório necessário para criar essa metodologia também recebeu financiamento da Competição Anual de Financiamento da Faculdade de Ciências e Engenharia (Wolverhampton) para a S.V.
Materials
| 10 mL autosampler vials | Agilent | 5188-5392 | 10 ml screwtop vials with |
| 18 mm vial caps | Agilent | 8010-0139 | Magnetic with PTFE/silicone septa |
| Autosampler | Agilent | GC120 PAL autosampler | |
| Capillary column | Agilent | HP5-MS | 30 m x 0.25 mm; 0.25 µm |
| Data analysis software | Agilent | – | ChemStation |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890B | |
| Inlet septa | Agilent | 5182-3442 | Merlin microseal |
| Mass Selective Detector | Agilent | 5977A | |
| Reporting software | Microsoft | – | Excel |
| Spectral library | NIST | – | NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library |
| Spectral library search program | NIST | – | MS Search v.2.2 |
| Splitless Inlet liner | Agilent | 5190-4048 | |
| SPME fibres | Agilent | SU57345U | 65 µm PDMS/DVB fibre |
Riferimenti
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