Croissance limitée des métaux de Neisseria gonorrhoeae pour la caractérisation des gènes sensibles aux métaux et l’acquisition de métaux auprès de l’hôte Ligands

Summary

Nous décrivons ici une méthode pour la croissance de Neisseria gonorrhoeae dans le milieu liquide métal-restreint pour faciliter l’expression des gènes pour l’apaisement de métal. Nous dénoncions également des expériences en aval pour caractériser le phénotype des gonocoques cultivés dans ces conditions. Ces méthodes peuvent être adaptées pour être adaptées à la caractérisation des gènes sensibles au métal chez d’autres bactéries.

Abstract

Les métaux traces tels que le fer et le zinc sont des nutriments vitaux connus pour jouer un rôle clé dans les processus procaryotiques, y compris la régulation des gènes, la catalyse et la structure des protéines. La séquestration du métal par les hôtes conduit souvent à une limitation du métal pour la bactérie. Cette limitation induit l’expression des gènes bactériens dont les produits protéiques permettent aux bactéries de surmonter leur environnement métallique limité. La caractérisation de ces gènes est un défi. Les bactéries doivent être cultivées dans des médias méticuleusement préparés qui permettent un accès suffisant aux métaux nutritionnels pour permettre la croissance bactérienne tout en maintenant un profil métallique propice à la réalisation de l’expression des gènes susmentionnés. En tant que tel, un équilibre délicat doit être établi pour les concentrations de ces métaux. La culture d’un organisme exigeant sur le plan nutritionnel tel que Neisseria gonorrhoeae, qui a évolué pour survivre uniquement dans l’hôte humain, ajoute un niveau supplémentaire de complexité. Ici, nous décrivons la préparation d’un milieu métallique défini limité suffisant pour permettre la croissance gonococcique et l’expression du gène désirée. Cette méthode permet à l’investigateur de chélater le fer et le zinc à partir de sources indésirables tout en complétant les médias avec des sources définies de fer ou de zinc, dont la préparation est également décrite. Enfin, nous présentons trois expériences qui utilisent ce média pour aider à caractériser les produits protéiques des gènes gonococciques régulés par les métaux.

Introduction

Neisseria gonorrhoeae provoque l’infection sexuellement transmissible commune gonorrhée. Pendant l’infection, Neisseria pathogène exprimer un répertoire de gènes métal-sensibles qui permettent aux bactéries de surmonter les efforts de restriction de métal par l’hôte humain^1,2,3. Les métaux traces comme le fer et le zinc jouent un rôle clé dans de nombreux processus cellulaires, tels que la liaison aux enzymes dans les sites catalytiques, la participation aux réactions redox, et comme facteurs structurels dans diverses protéines^4,5. Dans des conditions de métal limité, les loci métal-sensibles sont déprimés et leurs protéines résultantes peuvent aider à l’acquisition de ces éléments nutritifs. La caractérisation de ces gènes et protéines représente un défi technique unique pour le chercheur. Les ions métalliques doivent être retenus contre les bactéries afin d’induire la transcription de ces gènes à partir de leurs loci indigènes, mais la chélation efficace de ces ions à partir de médias chargés de métal peut être difficile à optimiser. Les différents profils métalliques de l’eau de source et la variation inhérente du lot au lot⁶ des ingrédients en poudre signifient que la quantité de chélateur nécessaire pour enlever un métal spécifique d’un milieu riche variera d’un endroit à l’autre, les vendeurs d’ingrédients, et même au fil du temps dans un seul laboratoire à mesure que l’inventaire chimique sera remplacé.

Pour contourner ce défi, nous décrivons la préparation d’un milieu défini qui est traité avec de la résine Chelex-100 pendant la préparation pour enlever les métaux traces de la solution. Ce milieu est suffisamment dense en nutriments pour permettre la croissance du gonocoque, qui est difficile à culture en dehors de l’hôte humain, et permet à l’investigateur d’introduire un profil métallique spécifique en additionnant leurs propres sources et concentrations définies de Métaux. La méthode d’addition contrôlée des métaux désirés au milieu appauvri augmente la consistance expérimentale et permet des expériences robustes et reproductibles indépendamment de facteurs tels que la source d’eau et le nombre de lot séchimique. En outre, ce support peut être déployé comme un liquide ou solide avec seulement des modifications mineures, ce qui le rend assez polyvalent.

Afin de démontrer l’utilité de ce milieu, nous énonçons un protocole pour son utilisation pour la croissance gonococcique et déécrivons trois expériences réussies pour caractériser les gènes de Neisseria sensibles aux métaux. Tout d’abord, nous préparons des lysates gonococciques à cellules entières à partir de cultures appauvries ou complétées par le métal et démontrons des niveaux variables de production de protéines à partir de loci sensibles au métal. Nous cifrayons alors un assay de croissance zinc-restreint dans lequel la croissance gonococcique est commandée par la supplémentation des sources spécifiques et utilisables de zinc. Enfin, nous montrons des essais de liaison qui démontrent des cellules gonococciques entières exprimant des récepteurs de surface sensibles au métal se liant à leurs ligands contenant du métal respectifs. La présentation réussie de surface de ces récepteurs exige la croissance dans le milieu métal-appauvri.

Le protocole actuel a été optimisé spécifiquement pour Neisseria gonorrhoeae, mais de nombreux autres agents pathogènes bactériens utilisent des stratégies d’acquisition de métaux pendant l’infection⁷, de sorte que ce protocole peut être adapté pour l’étude de l’homéostasie métallique dans d’autres bactéries. L’optimisation de ce média et de ces protocoles expérimentaux pour une utilisation dans d’autres bactéries nécessitera probablement une légère modification des concentrations de chélateurs métalliques et/ou du temps de traitement avec Chelex-100, car d’autres bactéries peuvent avoir des besoins métalliques légèrement différents de ceux du gonocoque. Le fer et le zinc sont les principaux métaux préoccupants pour les enquêtes décrites, mais d’autres métaux (p. ex., le manganèse) ont été démontrés comme critiques pour les bactéries, y compris Neisseria^8,9,10,11,12. En outre, des méthodes similaires ont été décrites pour les caractérisations métalliques dans le travail de culture cellulaire eucaryotique, qui peut également être considérée. ^{13 (en)}

Protocol

1. Préparation de solutions d’actions à moyen défini (MDP) traitées par Chelex Stock solution I Combiner NaCl (233,8 g), K2SO4 (40,0 g), NH4Cl (8,8 g), K2HPO4 (13,9 g) et KH2PO4 (10,9 g) dans de l’eau déionisée à un volume final de 1 L. Filtrer stériliser la solution et aliquot en tubes coniques de 50 ml. Conserver à -20 oC. Stock solution II Mélanger la thiamin…

Representative Results

Un milieu spécifique défini en l’absence de métaux traces pour la croissance de Neisseria gonorrhoeae a été développé et mis en œuvre pour la caractérisation des gènes sensibles aux métaux et de leurs produits géniques. Dans le protocole optimisé, le profil métallique des médias est contrôlé en ajoutant des métaux à la discrétion de l’enquêteur, plutôt que par la chélation titrée d’une cible métallique, ce qui permet un contrôle et une consistance …

Discussion

Les médias de croissance joue un rôle varié dans la recherche microbiologique. Les médias spécialisés sont utilisés pour la sélection, l’enrichissement et diverses autres applications pour de nombreux types d’études uniques. Une telle application est l’induction de gènes métal-sensibles, qui est typiquement accompli par l’addition d’un chélateur spécifique qui cible un ion métallique particulier. Cette méthode est limitée, car la quantité de chélation nécessaire pour divers métaux traces est…

Materials

125 mL sidearm flasks	Bellco	2578-S0030	Must be custom ordered
2-Mercaptoethanol	VWR	M131	Open in fume hood
3MM Paper	GE Health	3030-6461	Called "filter paper" in text
Agarose	Biolone	BIO-41025	Powder
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	A9434	Powder
Biotin	Sigma-Aldrich	B4501	Powder
Blotting grade blocker	Bio-Rad	170-6404	Nonfat dry milk
Bovine serum albumin	Roche	3116964001	Powder
Bovine transferrin	Sigma-Aldrich	T1428	Powder
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C5080	Powder
Calcium pantothenate	Sigma-Aldrich	C8731	Powder
Calprotectin	N/A	N/A	We are supplied with this by a collaborator
Chelex-100 Resin	Bio-Rad	142-2832	Wash with deionized water prior to use
Cotton-tipped sterile swab	Puritan	25-806	Cotton is better than polyester for this application
Deferoxamine	Sigma-Aldrich	D9533	Powder
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Powder
Dialysis cassette	Thermo	66380	Presoak in buffer prior to use
Dot blot apparatus	Schleicher & Schwell	10484138	Lock down lid as tightly as possible before sample loading
Ethanol	Koptec	V1016	Flammable liquid, store in flammables cabinet
Ferric chloride	Sigma-Aldrich	F7134	Irritant, do not inhale
Ferric nitrate nonahydrate	Sigma-Aldrich	F1143	Irritant, do not inhale
GC medium base	Difco	228950	Powder, already contains agar
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898	Powder
HEPES	Fisher	L-15694	Powder
Human transferrin	Sigma-Aldrich	T2030	Powder
Hypoxanthine	Sigma-Aldrich	H9377	Powder
Klett colorimeter	Manostat	37012-0000	Uses color transmission to assess culture density
L-alanine	Sigma-Aldrich	A7627	Powder
L-arginine	Sigma-Aldrich	A5006	Powder
L-asparagine monohydrate	Sigma-Aldrich	A8381	Powder
L-aspartate	Sigma-Aldrich	A9256	Powder
L-cysteine hydrochloride	Sigma-Aldrich	C1276	Powder
L-cystine	Sigma-Aldrich	C8755	Powder
L-glutamate	Sigma-Aldrich	G1251	Powder
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G3126	Powder
L-histidine monohydrochloride	Sigma-Aldrich	H8125	Powder
L-isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752	Powder
L-leucine	Sigma-Aldrich	L8000	Powder
L-lysine	Sigma-Aldrich	L5501	Powder
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625	Powder
L-phenylalanine	Sigma-Aldrich	P2126	Powder
L-proline	Sigma-Aldrich	P0380	Powder
L-serine	Sigma-Aldrich	S4500	Powder
L-threonine	Sigma-Aldrich	T8625	Powder
L-tryptophan	Sigma-Aldrich	T0254	Powder
L-tyrosine	Sigma-Aldrich	T3754	Powder
L-valine	Sigma-Aldrich	V0500	Powder
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506	Powder
Methanol	VWR	BDH1135-4LP	Flammable liquid, store in flammables cabinet
Nitrocellulose	GE Health	10600002	Keep in protective sheath until use
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	60356	Powder
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P9791	Powder
Potassium sulfate	Sigma-Aldrich	P0772	Powder
Potato starch	Sigma-Aldrich	S4251	Powder
Reduced glutathione	Sigma-Aldrich	G4251	Handle carefully. Can oxidize easily.
S100A7	N/A	N/A	We are supplied with this by a collaborator
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Powder
Sodium chloride	VWR	470302	Powder
Sodium citrate	Fisher	S279	Powder
Sodium hydroxide	Acros Organics	383040010	Highly hygroscopic
Thiamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	T4625	Powder
Thiamine pyrophosphate	Sigma-Aldrich	C8754	Also called cocarboxylase
TPEN	Sigma-Aldrich	P4413	Powder
Tris	VWR	497	Powder
Uracil	Sigma-Aldrich	U0750	Powder
Zinc sulfte heptahydrate	Sigma-Aldrich	204986	Irritant, do not inhale