धातु-उत्तरदायी जीन और मेजबान लिगांड्स से धातु अधिग्रहण के लक्षण वर्णन के लिए नेसेरिया गोनोरिया की धातु-सीमित वृद्धि
Summary
हम यहां धातु-प्रतिबंधित तरल माध्यम में नेसेरिया गोनोरिया के विकास के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं ताकि धातु तेज के लिए जीन की अभिव्यक्ति को सुगम बनाया जा सके । हम इन स्थितियों में उगाए गए गोनोकोची के फेनोटाइप की विशेषता के लिए डाउनस्ट्रीम प्रयोगों की रूपरेखा भी तैयार करते हैं। इन तरीकों को अन्य बैक्टीरिया में धातु-उत्तरदायी जीन के लक्षण वर्णन के लिए उपयुक्त होने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Abstract
आयरन और जिंक जैसी धातुओं का पता लगाने के जीन विनियमन, उत्प्रेरक, और प्रोटीन संरचना सहित प्रोकैरियोटिक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता महत्वपूर्ण पोषक तत्व हैं । मेजबानों द्वारा धातु की ज़ब्ती अक्सर जीवाणु के लिए धातु की सीमा की ओर जाता है। यह सीमा बैक्टीरियल जीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करती है जिसके प्रोटीन उत्पाद बैक्टीरिया को अपने धातु-सीमित वातावरण को दूर करने की अनुमति देते हैं। ऐसे जीन का लक्षण वर्णन चुनौतीपूर्ण है। बैक्टीरिया सावधानी से तैयार मीडिया में उगाया जाना चाहिए जो उपरोक्त जीन की अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए अनुकूल धातु प्रोफ़ाइल को बनाए रखते हुए बैक्टीरियल विकास की अनुमति देने के लिए पोषण धातुओं तक पर्याप्त पहुंच की अनुमति देता है। जैसे, इन धातुओं की सांद्रता के लिए एक नाजुक संतुलन स्थापित किया जाना चाहिए। नेसेरिया गोनोरियाजैसे पोषण के रूप में दुराग्रही जीव को बढ़ाना, जो केवल मानव मेजबान में जीवित रहने के लिए विकसित हुआ है, जटिलता का एक अतिरिक्त स्तर जोड़ता है। यहां, हम गोनोकोकल विकास और वांछित जीन अभिव्यक्ति की अनुमति देने के लिए पर्याप्त एक परिभाषित धातु-सीमित माध्यम की तैयारी का वर्णन करते हैं। यह विधि अन्वेषक को लोहे या जस्ता के परिभाषित स्रोतों के साथ मीडिया को पूरक करते हुए अवांछित स्रोतों से लोहे और जस्ता को चेलेट करने की अनुमति देती है, जिसकी तैयारी भी वर्णित है। अंत में, हम तीन प्रयोगों की रूपरेखा तैयार करते हैं जो धातु-विनियमित गोनोकोकल जीन के प्रोटीन उत्पादों की विशेषता में मदद करने के लिए इस मीडिया का उपयोग करते हैं।
Introduction
नेसेरिया गोनोरिया आम यौन संचारित संक्रमण गोनोरिया का कारण बनता है। संक्रमण के दौरान, रोगजनक निसेरिया धातु-उत्तरदायी जीन का प्रदर्शनों की सूची व्यक्त करते हैं जो बैक्टीरिया को मानव मेजबान1,2,3द्वारा धातु प्रतिबंध प्रयासों को दूर करने की अनुमति देता है। आयरन और जिंक जैसी धातुओं का पता लगाना कई सेलुलर प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जैसे उत्प्रेरक साइटों में एंजाइमों के लिए बाध्यकारी, रेडऑक्स प्रतिक्रियाओं में भागीदारी, और विभिन्न प्रोटीन4,5 में संरचनात्मक कारकोंकेरूप में। धातु-सीमित स्थितियों में, धातु-उत्तरदायी लोकी को दबाया जाता है और उनके परिणामी प्रोटीन इन पोषक तत्वों के अधिग्रहण में सहायता कर सकते हैं। इन जीन और प्रोटीन का लक्षण वर्णन अन्वेषक के लिए एक अनूठी तकनीकी चुनौती प्रस्तुत करता है। धातु आयनों को बैक्टीरिया से रोका जाना चाहिए ताकि उनके देशी लोकी से इन जीनों के प्रतिलेखन को प्रेरित किया जा सके, लेकिन धातु से लदे मीडिया से इन आयनों के प्रभावी चेलेशन को अनुकूलित करना मुश्किल हो सकता है। स्रोत पानी के विभिन्न धातु प्रोफाइल और पाउडर सामग्री के अंतर्निहित लॉट-टू-लॉट भिन्नता6 का मतलब है कि एक समृद्ध माध्यम से एक विशिष्ट धातु को हटाने के लिए आवश्यक चेलेटर की मात्रा विभिन्न स्थानों, घटक विक्रेताओं के बीच भिन्न होगी, और यहां तक कि रासायनिक इन्वेंट्री के रूप में एक प्रयोगशाला के भीतर समय के साथ भी बदल दिया जाता है।
इस चुनौती को दरकिनार करने के लिए, हम एक परिभाषित माध्यम की तैयारी का वर्णन करते हैं जिसे समाधान से ट्रेस धातुओं को हटाने की तैयारी के दौरान चेलेक्स-100 रेसिन के साथ इलाज किया जाता है। यह माध्यम गोनोकोकस के विकास के लिए अनुमति देने के लिए पर्याप्त पोषक तत्व घने है, जो मानव मेजबान के बाहर संस्कृति के लिए मुश्किल है, और अन्वेषक को अपने स्वयं के परिभाषित स्रोतों और सांद्रता के अलावा एक विशिष्ट धातु प्रोफ़ाइल पेश करने की अनुमति देता है धातुओं. समाप्त मध्यम करने के लिए वांछित धातुओं के नियंत्रित ऐड-बैक की विधि प्रयोगात्मक स्थिरता को बढ़ाती है और जल स्रोत और रासायनिक लॉट संख्या जैसे कारकों की परवाह किए बिना मजबूत, प्रतिकृति प्रयोगों के लिए अनुमति देती है। इसके अलावा, इस मीडिया को केवल मामूली संशोधनों के साथ या तो तरल या ठोस के रूप में तैनात किया जा सकता है, जिससे यह काफी बहुमुखी हो जाता है।
इस माध्यम की उपयोगिता को प्रदर्शित करने के लिए, हम गोनोकोकल विकास के लिए इसके उपयोग के लिए एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करते हैं और धातु-उत्तरदायी नेसेरिया जीन की विशेषता के लिए तीन सफल प्रयोगों का वर्णन करते हैं। सबसे पहले, हम धातु-समाप्त या पूरक संस्कृतियों से गोनोकोकल संपूर्ण-कोशिका लिसेट्स तैयार करते हैं और धातु-उत्तरदायी लोकी से प्रोटीन उत्पादन के परिवर्तनीय स्तरों को प्रदर्शित करते हैं। हम तो एक जस्ता प्रतिबंधित विकास परख जिसमें गोनोकोकल विकास विशिष्ट, useable जस्ता स्रोतों के पूरक द्वारा नियंत्रित किया जाता है रूपरेखा । अंत में, हम बाध्यकारी परख दिखाते हैं जो धातु-उत्तरदायी सतह रिसेप्टर्स को व्यक्त करने वाली पूरी गोनोकोकल कोशिकाओं को प्रदर्शित करते हैं जो अपने संबंधित धातु युक्त लिगांड के लिए बाध्यकारी हैं। इन रिसेप्टर्स की सफल सतह प्रस्तुति के लिए धातु-समाप्त माध्यम में वृद्धि की आवश्यकता होती है।
वर्तमान प्रोटोकॉल विशेष रूप से नेसेरिया गोनोरियाके लिए अनुकूलित किया गया था, लेकिन कई अन्य जीवाणु रोगजनक संक्रमण7के दौरान धातु अधिग्रहण रणनीतियों को नियोजित करते हैं, इसलिए इस प्रोटोकॉल को अन्य बैक्टीरिया में धातु होमोस्टोसिस के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस मीडिया और अन्य बैक्टीरिया में उपयोग के लिए इन प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने की संभावना धातु चेलेटर सांद्रता के मामूली संशोधन और/या Chelex-१०० के साथ उपचार के समय की आवश्यकता होगी, के रूप में अंय बैक्टीरिया gonococcus की तुलना में थोड़ा अलग धातु आवश्यकताओं हो सकता है । आयरन और जिंक वर्णित जांच के लिए चिंता की प्राथमिक धातुएं हैं, लेकिन अन्य धातुओं (जैसे, मैंगनीज) को बैक्टीरिया के लिए महत्वपूर्ण के रूप में प्रदर्शित किया गया है, जिसमें निसेरिया8,9,10,11, 12शामिल हैं। इसके अलावा, यूकेरियोटिक सेल कल्चर वर्क में धातु के लक्षणों के लिए इसी तरह के तरीकों का वर्णन किया गया है, जिस पर भी विचार किया जा सकता है। 13
Protocol
Representative Results
Discussion
विकास मीडिया माइक्रोबायोलॉजिकल अनुसंधान में विभिन्न भूमिकाओं में कार्य करता है। विशेष मीडिया का उपयोग कई अद्वितीय प्रकार के अध्ययन के लिए चयन, संवर्धन और विभिन्न अन्य अनुप्रयोगों के लिए किया जाता ह?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को NIH अनुदान R01 AI125421, R01 AI127793, और U19 AI144182 द्वारा समर्थित किया गया था । लेखन लेखक उन सभी प्रयोगशाला सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहेगा जिन्होंने इस विधि की प्रूफरीडिंग और समीक्षा में योगदान दिया।
Materials
| 125 mL sidearm flasks | Bellco | 2578-S0030 | Must be custom ordered |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | M131 | Open in fume hood |
| 3MM Paper | GE Health | 3030-6461 | Called "filter paper" in text |
| Agarose | Biolone | BIO-41025 | Powder |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | Powder |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Powder |
| Blotting grade blocker | Bio-Rad | 170-6404 | Nonfat dry milk |
| Bovine serum albumin | Roche | 3116964001 | Powder |
| Bovine transferrin | Sigma-Aldrich | T1428 | Powder |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C5080 | Powder |
| Calcium pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | Powder |
| Calprotectin | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Chelex-100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | Wash with deionized water prior to use |
| Cotton-tipped sterile swab | Puritan | 25-806 | Cotton is better than polyester for this application |
| Deferoxamine | Sigma-Aldrich | D9533 | Powder |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Powder |
| Dialysis cassette | Thermo | 66380 | Presoak in buffer prior to use |
| Dot blot apparatus | Schleicher & Schwell | 10484138 | Lock down lid as tightly as possible before sample loading |
| Ethanol | Koptec | V1016 | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Ferric chloride | Sigma-Aldrich | F7134 | Irritant, do not inhale |
| Ferric nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | F1143 | Irritant, do not inhale |
| GC medium base | Difco | 228950 | Powder, already contains agar |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Powder |
| HEPES | Fisher | L-15694 | Powder |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T2030 | Powder |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | Powder |
| Klett colorimeter | Manostat | 37012-0000 | Uses color transmission to assess culture density |
| L-alanine | Sigma-Aldrich | A7627 | Powder |
| L-arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Powder |
| L-asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A8381 | Powder |
| L-aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | Powder |
| L-cysteine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C1276 | Powder |
| L-cystine | Sigma-Aldrich | C8755 | Powder |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Powder |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | Powder |
| L-histidine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | H8125 | Powder |
| L-isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | Powder |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | Powder |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | Powder |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | Powder |
| L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | Powder |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Powder |
| L-serine | Sigma-Aldrich | S4500 | Powder |
| L-threonine | Sigma-Aldrich | T8625 | Powder |
| L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | Powder |
| L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | Powder |
| L-valine | Sigma-Aldrich | V0500 | Powder |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Powder |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Nitrocellulose | GE Health | 10600002 | Keep in protective sheath until use |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 60356 | Powder |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Powder |
| Potassium sulfate | Sigma-Aldrich | P0772 | Powder |
| Potato starch | Sigma-Aldrich | S4251 | Powder |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G4251 | Handle carefully. Can oxidize easily. |
| S100A7 | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium chloride | VWR | 470302 | Powder |
| Sodium citrate | Fisher | S279 | Powder |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 383040010 | Highly hygroscopic |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | Powder |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Also called cocarboxylase |
| TPEN | Sigma-Aldrich | P4413 | Powder |
| Tris | VWR | 497 | Powder |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | Powder |
| Zinc sulfte heptahydrate | Sigma-Aldrich | 204986 | Irritant, do not inhale |
Riferimenti
- Cornelissen, C. N. Subversion of nutritional immunity by the pathogenic Neisseriae. Pathogens and Disease. 76 (1), (2018).
- Ducey, T. F., Carson, M. B., Orvis, J., Stintzi, A. P., Dyer, D. W. Identification of the iron-responsive genes of Neisseria gonorrhoeae by microarray analysis in defined medium. Journal of Bacteriology. 187 (14), 4865-4874 (2005).
- Pawlik, M. C., et al. The zinc-responsive regulon of Neisseria meningitidis comprises 17 genes under control of a Zur element. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6594-6603 (2012).
- Andreini, C., Banci, L., Bertini, I., Rosato, A. Zinc through the three domains of life. Journal of Proteome Research. 5 (11), 3173-3178 (2006).
- Frawley, E. R., Fang, F. C. The ins and outs of bacterial iron metabolism. Molecular Microbiology. 93 (4), 609-616 (2014).
- Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-Lot Variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
- Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
- Lopez, C. A., Skaar, E. P. The Impact of Dietary Transition Metals on Host-Bacterial Interactions. Cell Host Microbe. 23 (6), 737-748 (2018).
- Kehl-Fie, T. E., et al. MntABC and MntH contribute to systemic Staphylococcus aureus infection by competing with calprotectin for nutrient manganese. Infection and Immunity. 81 (9), 3395-3405 (2013).
- Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 218-224 (2010).
- Seib, K. L., et al. Defenses against oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae: a system tailored for a challenging environment. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (2), 344-361 (2006).
- Wu, H. J., et al. PerR controls Mn-dependent resistance to oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae. Molecular Microbiology. 60 (2), 401-416 (2006).
- Rayner, M. H., Suzuki, K. T. A simple and effective method for the removal of trace metal cations from a mammalian culture medium supplemented with 10% fetal calf serum. Biometals. 8 (3), 188-192 (1995).
- Kellogg, D. S., Peacock, W. L., Deacon, W. E., Brown, L., Pirkle, D. I. Neisseria Gonorrhoeae. I. Virulence Genetically Linked to Clonal Variation. Journal of Bacteriology. 85, 1274-1279 (1963).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Heinicke, E., Kumar, U., Munoz, D. G. Quantitative dot-blot assay for proteins using enhanced chemiluminescence. Journal of Immunological Methods. 152 (2), 227-236 (1992).
- Jean, S., Juneau, R. A., Criss, A. K., Cornelissen, C. N. Neisseria gonorrhoeae Evades Calprotectin-Mediated Nutritional Immunity and Survives Neutrophil Extracellular Traps by Production of TdfH. Infection and Immunity. 84 (10), 2982-2994 (2016).
- Stork, M., et al. Zinc piracy as a mechanism of Neisseria meningitidis for evasion of nutritional immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003733 (2013).
- Maurakis, S., et al. The novel interaction between Neisseria gonorrhoeae TdfJ and human S100A7 allows gonococci to subvert host zinc restriction. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007937 (2019).
- Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Iron piracy: acquisition of transferrin-bound iron by bacterial pathogens. Molecular Microbiology. 14 (5), 843-850 (1994).
- Quillin, S. J., Seifert, H. S. Neisseria gonorrhoeae host adaptation and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (4), 226-240 (2018).
- Platt, D. J. Carbon dioxide requirement of Neisseria gonorrhoeae growing on a solid medium. Journal of Clinical Microbiology. 4 (2), 129-132 (1976).
- Grim, K. P., et al. The Metallophore Staphylopine Enables Staphylococcus aureus To Compete with the Host for Zinc and Overcome Nutritional Immunity. MBio. 8 (5), 01281-01317 (2017).
- Helbig, K., Bleuel, C., Krauss, G. J., Nies, D. H. Glutathione and transition-metal homeostasis in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 190 (15), 5431-5438 (2008).
- Calmettes, C., et al. The molecular mechanism of Zinc acquisition by the neisserial outer-membrane transporter ZnuD. Nature Communications. 6, 7996 (2015).
- Hubert, K., et al. ZnuD, a potential candidate for a simple and universal Neisseria meningitidis vaccine. Infection and Immunity. 81 (6), 1915-1927 (2013).
- Kumar, P., Sannigrahi, S., Tzeng, Y. L. The Neisseria meningitidis ZnuD zinc receptor contributes to interactions with epithelial cells and supports heme utilization when expressed in Escherichia coli. Infection and Immunity. 80 (2), 657-667 (2012).
- Stork, M., et al. An outer membrane receptor of Neisseria meningitidis involved in zinc acquisition with vaccine potential. PLoS Pathogens. 6, 1000969 (2010).
- Rosadini, C. V., Gawronski, J. D., Raimunda, D., Argüello, J. M., Akerley, B. J. A novel zinc binding system, ZevAB, is critical for survival of nontypeable Haemophilus influenzae in a murine lung infection model. Infection and Immunity. 79 (8), 3366-3376 (2011).
- Ammendola, S., et al. High-affinity Zn2+ uptake system ZnuABC is required for bacterial zinc homeostasis in intracellular environments and contributes to the virulence of Salmonella enterica. Infection and Immunity. 75 (12), 5867-5876 (2007).
- Gabbianelli, R., et al. Role of ZnuABC and ZinT in Escherichia coli O157:H7 zinc acquisition and interaction with epithelial cells. BMC Microbiology. 11, 36 (2011).
- Biswas, G. D., Anderson, J. E., Chen, C. J., Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Identification and functional characterization of the Neisseria gonorrhoeae lbpB gene product. Infection and Immunity. 67 (1), 455-459 (1999).
- Biswas, G. D., Sparling, P. F. Characterization of lbpA, the structural gene for a lactoferrin receptor in Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 63 (8), 2958-2967 (1995).
- Chen, C. J., Sparling, P. F., Lewis, L. A., Dyer, D. W., Elkins, C. Identification and purification of a hemoglobin-binding outer membrane protein from Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 64 (12), 5008-5014 (1996).
- Wong, C. T., et al. Structural analysis of haemoglobin binding by HpuA from the Neisseriaceae family. Nature Communications. 6, 10172 (2015).
- Carson, S. D., Klebba, P. E., Newton, S. M., Sparling, P. F. Ferric enterobactin binding and utilization by Neisseria gonorrhoeae. Journal of Bacteriology. 181 (9), 2895-2901 (1999).
- Tseng, H. J., Srikhanta, Y., McEwan, A. G., Jennings, M. P. Accumulation of manganese in Neisseria gonorrhoeae correlates with resistance to oxidative killing by superoxide anion and is independent of superoxide dismutase activity. Molecular Microbiology. 40 (5), 1175-1186 (2001).
