Металл-ограниченный рост Neisseria gonorrhoeae для характеристики Металл-ответственных генов и приобретения металла от Хост Лигандс
Summary
Мы описываем здесь метод для роста Neisseria gonorrhoeae в метал-ограниченной жидкой среде для облегчения экспрессии генов для поглощения металла. Мы также наметить вниз по течению эксперименты, чтобы охарактеризовать фенотип гонококки, выращенные в этих условиях. Эти методы могут быть адаптированы, чтобы быть пригодными для характеристики металлочувствительных генов в других бактериях.
Abstract
След металлов, таких как железо и цинк являются жизненно важными питательными веществами, как известно, играют ключевую роль в прокариотических процессов, включая регуляцию генов, катализ и структуру белка. Улавливание металла хостами часто приводит к ограничению металла для бактерии. Это ограничение индуцирует экспрессию бактериальных генов, белковые продукты которых позволяют бактериям преодолевать ограниченную металлом окружающую среду. Характеристика таких генов является сложной задачей. Бактерии должны быть выращены в тщательно подготовленных средствах массовой информации, что позволяет достаточный доступ к питательным металлам, чтобы позволить рост бактерий при сохранении металлического профиля, способствующих достижению экспрессии вышеупомянутых генов. Таким образом, необходимо установить хрупкий баланс концентраций этих металлов. Выращивание питательно примиренного организма, такого как Neisseria gonorrhoeae,который эволюционировал, чтобы выжить только у человека-хозяина, добавляет дополнительный уровень сложности. Здесь мы описываем подготовку определенной метал-ограниченной среды, достаточной для того, чтобы позволить гонококковому росту и желаемому экспрессии генов. Этот метод позволяет следователю хелат железа и цинка из нежелательных источников, дополняя средства массовой информации с определенными источниками железа или цинка, подготовка которых также описана. Наконец, мы наметили три эксперимента, которые используют это средства массовой информации, чтобы помочь охарактеризовать белковые продукты металлорегулируемых гонококковых генов.
Introduction
Neisseria gonorrhoeae вызывает распространенную инфекцию, передаемую половым путем, гонореей. Во время инфекции, патогенные Neisseria выразить репертуар металл-чувствительных генов, которые позволяют бактериям преодолеть усилия ограничения металла человека хозяина1,2,3. След металлов, как железо и цинк играют ключевую роль во многих клеточных процессов, таких как связывание с ферментами в каталитических участках, участие в редокс реакции, и как структурные факторы в различных белков4,5. В метал-ограниченных условиях, металл-реагируя loci derepressed и их резцирующие протеины могут помочь присваивать эти питательные вещества. Характеристика этих генов и белков представляет собой уникальную техническую задачу для исследователя. Ионы металла должны быть удержаны от бактерий, чтобы вызвать транскрипцию этих генов из их родной локусы, но эффективное хелатора этих ионов из металлических носителей может быть трудно оптимизировать. Различные металлические профили исходной воды и присущие много-много вариации6 порошкообразных ингредиентов означает, что количество хелатора, необходимых для удаления конкретного металла из богатой среде будет варьироваться в зависимости от различных местах, ингредиент поставщиков, и даже с течением времени в рамках одной лаборатории, как химический инвентарь заменяется.
Чтобы обойти эту задачу, мы описываем подготовку определенной среды, которая обрабатывается с помощью моли chelex-100 во время подготовки к удалению следов металлов из раствора. Эта среда является достаточно питательной плотной, чтобы обеспечить рост гонококка, который трудно культуры за пределами человеческого хозяина, и позволяет следователю ввести конкретный профиль металла путем добавления своих собственных определенных источников и концентраций Металлов. Метод контролируемого дополнения желаемых металлов к истощению среды увеличивает экспериментальную консистенцию и позволяет проводить надежные, воспроизводимые эксперименты независимо от таких факторов, как источник воды и химические номера лотов. Кроме того, эти носители могут быть развернуты как жидкость или твердые только с незначительными изменениями, что делает его довольно универсальным.
Для того, чтобы продемонстрировать полезность этой среды, мы наметили протокол для его использования для гонококкового роста и описать три успешных эксперимента для характеристики металлоотвечающего генов Neisseria. Во-первых, мы готовим гонококковые цельноклеточные лизаты из истощенных металлом или дополненных культур и демонстрируем переменные уровни производства белка из металлочувствительных локусов. Затем мы наметили цинк-ограниченный обзор роста, в котором гонококковый рост контролируется добавками конкретных, пригодных для использования источников цинка. Наконец, мы показываем связывающие анализы, которые демонстрируют целые гонококковые клетки, выражающие металлореакционные поверхностные рецепторы, связывающиеся с их соответствующими металлосодержащих лигандами. Успешное поверхностное представление этих рецепторов требует роста в металло-обеденный среды.
Настоящий протокол был оптимизирован специально для Neisseria gonorrhoeae, но многие другие бактериальные патогены используют стратегии приобретения металла во время инфекции7, так что этот протокол может быть адаптирован для изучения металла гомеостаза в других бактерий. Оптимизация этого носителя и этих экспериментальных протоколов для использования в других бактериях, скорее всего, потребует незначительной модификации концентрации металлического хелатора и/или времени лечения с Chelex-100, так как другие бактерии могут иметь несколько иные требования к металлу, чем у гонококка. Утюг и цинк являются основными металлами, вызывающими озабоченность в связи с описанными исследованиями, но другие металлы (например, марганец) были продемонстрированы как критические для бактерий, в том числе Neisseria8,9,10,11,12. Кроме того, аналогичные методы были описаны для характеристик металла в работе эукариотической клеточной культуры, которые также могут быть рассмотрены. 13 Год
Protocol
Representative Results
Discussion
Средства роста играют различные роли в микробиологических исследованиях. Специализированные средства массовой информации используются для отбора, обогащения и различных других приложений для многих уникальных типов исследований. Одним из таких применений является индукция металло…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами NIH R01 AI125421, R01 AI127793 и U19 AI144182. Автор письма хотел бы поблагодарить всех членов лаборатории, которые внесли свой вклад в корректуру и обзор этого метода.
Materials
| 125 mL sidearm flasks | Bellco | 2578-S0030 | Must be custom ordered |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | M131 | Open in fume hood |
| 3MM Paper | GE Health | 3030-6461 | Called "filter paper" in text |
| Agarose | Biolone | BIO-41025 | Powder |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | Powder |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Powder |
| Blotting grade blocker | Bio-Rad | 170-6404 | Nonfat dry milk |
| Bovine serum albumin | Roche | 3116964001 | Powder |
| Bovine transferrin | Sigma-Aldrich | T1428 | Powder |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C5080 | Powder |
| Calcium pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | Powder |
| Calprotectin | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Chelex-100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | Wash with deionized water prior to use |
| Cotton-tipped sterile swab | Puritan | 25-806 | Cotton is better than polyester for this application |
| Deferoxamine | Sigma-Aldrich | D9533 | Powder |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Powder |
| Dialysis cassette | Thermo | 66380 | Presoak in buffer prior to use |
| Dot blot apparatus | Schleicher & Schwell | 10484138 | Lock down lid as tightly as possible before sample loading |
| Ethanol | Koptec | V1016 | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Ferric chloride | Sigma-Aldrich | F7134 | Irritant, do not inhale |
| Ferric nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | F1143 | Irritant, do not inhale |
| GC medium base | Difco | 228950 | Powder, already contains agar |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Powder |
| HEPES | Fisher | L-15694 | Powder |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T2030 | Powder |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | Powder |
| Klett colorimeter | Manostat | 37012-0000 | Uses color transmission to assess culture density |
| L-alanine | Sigma-Aldrich | A7627 | Powder |
| L-arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Powder |
| L-asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A8381 | Powder |
| L-aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | Powder |
| L-cysteine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C1276 | Powder |
| L-cystine | Sigma-Aldrich | C8755 | Powder |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Powder |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | Powder |
| L-histidine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | H8125 | Powder |
| L-isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | Powder |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | Powder |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | Powder |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | Powder |
| L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | Powder |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Powder |
| L-serine | Sigma-Aldrich | S4500 | Powder |
| L-threonine | Sigma-Aldrich | T8625 | Powder |
| L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | Powder |
| L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | Powder |
| L-valine | Sigma-Aldrich | V0500 | Powder |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Powder |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Nitrocellulose | GE Health | 10600002 | Keep in protective sheath until use |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 60356 | Powder |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Powder |
| Potassium sulfate | Sigma-Aldrich | P0772 | Powder |
| Potato starch | Sigma-Aldrich | S4251 | Powder |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G4251 | Handle carefully. Can oxidize easily. |
| S100A7 | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium chloride | VWR | 470302 | Powder |
| Sodium citrate | Fisher | S279 | Powder |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 383040010 | Highly hygroscopic |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | Powder |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Also called cocarboxylase |
| TPEN | Sigma-Aldrich | P4413 | Powder |
| Tris | VWR | 497 | Powder |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | Powder |
| Zinc sulfte heptahydrate | Sigma-Aldrich | 204986 | Irritant, do not inhale |
Riferimenti
- Cornelissen, C. N. Subversion of nutritional immunity by the pathogenic Neisseriae. Pathogens and Disease. 76 (1), (2018).
- Ducey, T. F., Carson, M. B., Orvis, J., Stintzi, A. P., Dyer, D. W. Identification of the iron-responsive genes of Neisseria gonorrhoeae by microarray analysis in defined medium. Journal of Bacteriology. 187 (14), 4865-4874 (2005).
- Pawlik, M. C., et al. The zinc-responsive regulon of Neisseria meningitidis comprises 17 genes under control of a Zur element. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6594-6603 (2012).
- Andreini, C., Banci, L., Bertini, I., Rosato, A. Zinc through the three domains of life. Journal of Proteome Research. 5 (11), 3173-3178 (2006).
- Frawley, E. R., Fang, F. C. The ins and outs of bacterial iron metabolism. Molecular Microbiology. 93 (4), 609-616 (2014).
- Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-Lot Variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
- Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
- Lopez, C. A., Skaar, E. P. The Impact of Dietary Transition Metals on Host-Bacterial Interactions. Cell Host Microbe. 23 (6), 737-748 (2018).
- Kehl-Fie, T. E., et al. MntABC and MntH contribute to systemic Staphylococcus aureus infection by competing with calprotectin for nutrient manganese. Infection and Immunity. 81 (9), 3395-3405 (2013).
- Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 218-224 (2010).
- Seib, K. L., et al. Defenses against oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae: a system tailored for a challenging environment. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (2), 344-361 (2006).
- Wu, H. J., et al. PerR controls Mn-dependent resistance to oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae. Molecular Microbiology. 60 (2), 401-416 (2006).
- Rayner, M. H., Suzuki, K. T. A simple and effective method for the removal of trace metal cations from a mammalian culture medium supplemented with 10% fetal calf serum. Biometals. 8 (3), 188-192 (1995).
- Kellogg, D. S., Peacock, W. L., Deacon, W. E., Brown, L., Pirkle, D. I. Neisseria Gonorrhoeae. I. Virulence Genetically Linked to Clonal Variation. Journal of Bacteriology. 85, 1274-1279 (1963).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Heinicke, E., Kumar, U., Munoz, D. G. Quantitative dot-blot assay for proteins using enhanced chemiluminescence. Journal of Immunological Methods. 152 (2), 227-236 (1992).
- Jean, S., Juneau, R. A., Criss, A. K., Cornelissen, C. N. Neisseria gonorrhoeae Evades Calprotectin-Mediated Nutritional Immunity and Survives Neutrophil Extracellular Traps by Production of TdfH. Infection and Immunity. 84 (10), 2982-2994 (2016).
- Stork, M., et al. Zinc piracy as a mechanism of Neisseria meningitidis for evasion of nutritional immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003733 (2013).
- Maurakis, S., et al. The novel interaction between Neisseria gonorrhoeae TdfJ and human S100A7 allows gonococci to subvert host zinc restriction. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007937 (2019).
- Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Iron piracy: acquisition of transferrin-bound iron by bacterial pathogens. Molecular Microbiology. 14 (5), 843-850 (1994).
- Quillin, S. J., Seifert, H. S. Neisseria gonorrhoeae host adaptation and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (4), 226-240 (2018).
- Platt, D. J. Carbon dioxide requirement of Neisseria gonorrhoeae growing on a solid medium. Journal of Clinical Microbiology. 4 (2), 129-132 (1976).
- Grim, K. P., et al. The Metallophore Staphylopine Enables Staphylococcus aureus To Compete with the Host for Zinc and Overcome Nutritional Immunity. MBio. 8 (5), 01281-01317 (2017).
- Helbig, K., Bleuel, C., Krauss, G. J., Nies, D. H. Glutathione and transition-metal homeostasis in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 190 (15), 5431-5438 (2008).
- Calmettes, C., et al. The molecular mechanism of Zinc acquisition by the neisserial outer-membrane transporter ZnuD. Nature Communications. 6, 7996 (2015).
- Hubert, K., et al. ZnuD, a potential candidate for a simple and universal Neisseria meningitidis vaccine. Infection and Immunity. 81 (6), 1915-1927 (2013).
- Kumar, P., Sannigrahi, S., Tzeng, Y. L. The Neisseria meningitidis ZnuD zinc receptor contributes to interactions with epithelial cells and supports heme utilization when expressed in Escherichia coli. Infection and Immunity. 80 (2), 657-667 (2012).
- Stork, M., et al. An outer membrane receptor of Neisseria meningitidis involved in zinc acquisition with vaccine potential. PLoS Pathogens. 6, 1000969 (2010).
- Rosadini, C. V., Gawronski, J. D., Raimunda, D., Argüello, J. M., Akerley, B. J. A novel zinc binding system, ZevAB, is critical for survival of nontypeable Haemophilus influenzae in a murine lung infection model. Infection and Immunity. 79 (8), 3366-3376 (2011).
- Ammendola, S., et al. High-affinity Zn2+ uptake system ZnuABC is required for bacterial zinc homeostasis in intracellular environments and contributes to the virulence of Salmonella enterica. Infection and Immunity. 75 (12), 5867-5876 (2007).
- Gabbianelli, R., et al. Role of ZnuABC and ZinT in Escherichia coli O157:H7 zinc acquisition and interaction with epithelial cells. BMC Microbiology. 11, 36 (2011).
- Biswas, G. D., Anderson, J. E., Chen, C. J., Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Identification and functional characterization of the Neisseria gonorrhoeae lbpB gene product. Infection and Immunity. 67 (1), 455-459 (1999).
- Biswas, G. D., Sparling, P. F. Characterization of lbpA, the structural gene for a lactoferrin receptor in Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 63 (8), 2958-2967 (1995).
- Chen, C. J., Sparling, P. F., Lewis, L. A., Dyer, D. W., Elkins, C. Identification and purification of a hemoglobin-binding outer membrane protein from Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 64 (12), 5008-5014 (1996).
- Wong, C. T., et al. Structural analysis of haemoglobin binding by HpuA from the Neisseriaceae family. Nature Communications. 6, 10172 (2015).
- Carson, S. D., Klebba, P. E., Newton, S. M., Sparling, P. F. Ferric enterobactin binding and utilization by Neisseria gonorrhoeae. Journal of Bacteriology. 181 (9), 2895-2901 (1999).
- Tseng, H. J., Srikhanta, Y., McEwan, A. G., Jennings, M. P. Accumulation of manganese in Neisseria gonorrhoeae correlates with resistance to oxidative killing by superoxide anion and is independent of superoxide dismutase activity. Molecular Microbiology. 40 (5), 1175-1186 (2001).
